Presentation is loading. Please wait.

Presentation is loading. Please wait.

균주 개량 Strain Development

Similar presentations


Presentation on theme: "균주 개량 Strain Development"— Presentation transcript:

1 균주 개량 Strain Development
생물환경학과 김정호 Department of Bio-Environmental Science

2 균주 개량 미생물 공정의 생산성 향상 방법 균주 개량의 중요성 균주 개량에 필요한 지식 우수 균주 선발 (Screening)
산업미생물학 균주 개량 미생물 공정의 생산성 향상 방법 우수 균주 선발 (Screening) 균주 개량 (Strain improvement, Strain development) 생산성 향상, 결점 보완 최적조건 확립 (Optimal condition) 균주 개량의 중요성 균주 개량에 필요한 지식 생합성 : 대사경로 및 대사조절 유전자 : 유전자의 염기서열, 유전자의 발현 물질의 세포외 분비

3 균주 개량∙개발의 목표 물질 생산성 향상 : 생산량, 수율 물질 특성 개선 신물질 생산 : 유전자 조작 미생물
산업미생물학 균주 개량∙개발의 목표 물질 생산성 향상 : 생산량, 수율 물질 특성 개선 신물질 생산 : 유전자 조작 미생물 공정 생산성 향상 부산물 생산 감소 발효시간 단축 값싼 기질 이용성 산소 소모량 감소 파아지 저항성 고농도 탄소원/질소원 내성 세포 형태 변화 – 세포 분리 용이 거품 형성 저하 멸균 용이

4 미생물 균주 개량∙개발 방법 각 방법은 장단점이 있음 두 가지 이상의 방법을 혼용할 수 있음 돌연변이 (mutation)
산업미생물학 미생물 균주 개량∙개발 방법 돌연변이 (mutation) 균주/대사경로에 대한 생화학적 유전적 지식이 부족해도 사용 가능함 기술적으로 간단함 유전자 재조합 (genetic recombination) 다양한 돌연변이주가 확보되었을 때 아주 유용함 생화학적, 유전적 지식이 부족한 경우에도 가능 (원형질체 융합) 유전자 조작 (Gene cloning, in vitro genetic manipulation) 유전적 지식이 필요함 (limiting factors) 정밀한 조작 가능 : 특정 효소, 특정 부위 동식물 유래 물질 생산 가능 Site-directed mutagenesis와 같이 사용하면 매우 효과적 각 방법은 장단점이 있음 두 가지 이상의 방법을 혼용할 수 있음

5 미생물 균주 개량∙개발 방법 돌연변이 (mutation) 유전자 재조합 (genetic recombination)
산업미생물학 미생물 균주 개량∙개발 방법 돌연변이 (mutation) 유전자 재조합 (genetic recombination) 자연적 재조합 (in vivo genetic recombination) 진균 : 유성생식 (sexual reproduction) 준유성생식 (parasexual reproduction) 세균 : 형질전환(transformation)        접합(conjugation)        형질도입(transduction)  원형질체 융합(protoplast fusion) (in vitro genetic recombination) 유전자 조작 (Gene cloning, in vitro genetic manipulation)

6 돌연변이 돌연변이 (Mutation, Mutagenesis) 한 세포내의 유전정보(DNA 염기서열) 변화 (mutation)
산업미생물학 돌연변이 돌연변이 (Mutation, Mutagenesis) 한 세포내의 유전정보(DNA 염기서열) 변화 (mutation) a permanent alteration of the nucleotide sequence 세포 사이에 유전물질의 교환이 없음 변화가 자손에게 전달 돌연변이 유발 (mutagenesis) 정확히 수리되지 않은 DNA 손상 DNA damage Error-free repair ⇒ No mutation Error-prone repair ⇒ Mutation, Death Not repaired ⇒ Death 복제 과정의 실수 이동 유전물질에 삽입 또는 결실

7 돌연변이 (Mutation) 야생형 (wild type) → 돌연변이주 (mutant)
산업미생물학 돌연변이 (Mutation) 야생형 (wild type) → 돌연변이주 (mutant) 돌연변이 결과 표현형질은 변하지 않을 수도 있음 유전형 (genotype) : nucleotide sequence 표현형 (phenotype) : observable characteristics 중요성 진화 (evolution) 암 (cancer) 균주 개량 (strain improvement) 대부분의 돌연변이는 해로움 일부만 이로운 결과 harmful (deleterious) mutation beneficial (advantageous) mutation neutral mutation

8 DNA 염기서열의 변화 ⇨ -A-B-C-X-E-F-G- : 염기치환 ⇨ -A-B-C-X-D-E-F-G- : 염기첨가
산업미생물학 DNA 염기서열의 변화        ⇨ -A-B-C-X-E-F-G-           : 염기치환 ⇨ -A-B-C-X-D-E-F-G-     : 염기첨가                ⇨ -A-B-C-E-F-G-  (D)            : 염기결손 -A-B-C-D-E-F-G-  ⇨ -A-B-C-A-B-C-D-E-F-G- : 중복                        ⇨ -A-B-C-L-M-N-D-E-F-G- : 전좌   ⇨ -A-B-C-E-D-F-G-          : 역위 염기치환 : base substitution (point mutation) (transition, transversion) (염기)첨가 : base addition (염기)결손 : base deletion 중복 : duplication 전좌 : translocation 역위 : inversion

9 점돌연변이 (point mutation)
산업미생물학 점돌연변이 (point mutation) 염기치환 (base substitution) 틀 밀림돌연변이 (frameshift mutation, 틀 이동 돌연변이) 첨가(base addition) 결손(base deletion) 돌연변이 유전자 돌연변이 (Gene mutation) 유전자 내의 염기서열 변화 염색체 돌연변이 (Chromosome mutation) 염색체의 일부분 결실, 첨가, 재배열 유전체 돌연변이 (Genome mutation) 염색체 수의 변화

10 염기치환의 결과 ...A T G...5' A A C T A G T A T T A C T T G A T C A T A A T G
산업미생물학 염기치환의 결과                           '...T A C...                                  A T G...5'                                 ⇙                           ⇘                   염기치환                         정상적 복제        ⇩          ⇩              ⇩            ⇩        A A C        T A G        T A T          T A C   T T G       A T C         A T A            A T G        ⇩            ⇩            ⇩               ⇩ (전사) A A C         U A G         U A U            U A C  : mRNA    (아스파라긴)    (정지코돈)      (티로신)            (티로신)         ⇩             ⇩            ⇩                ⇩ (해독)  비정상 단백질  불완전 단백질     정상 단백질         정상 단백질  Missense      Nonsense       Silent              Wild type  mutation     mutation        mutation         (야생형)       

11 Silent mutation (침묵 돌연변이)
산업미생물학 Missense mutation 염기치환의 결과 다른 아미노산에 대응하는 유전암호를 갖게 됨 원래 단백질과 아미노산 서열이 다른 단백질 합성 Nonsense mutation 어느 아미노산에도 대응하지 않는 유전암호를 갖게 됨 nonsense codon(stop codon) : UAA, UAG, UGA 단백질 합성 정지, 원래보다 짧은 단백질이 만들어짐 Silent mutation (침묵 돌연변이) 유전자의 염기서열을 변했으나 (유전형, genotype) 단백질의 아미노산 서열은 변하지 않음 (표현형, phenotype) 코돈의 퇴행성(codon degeneracy): 한 아미노산에 대응하는 triplet codon이 여러 개인 현상 64 triplet conds vs. 20 amino acids

12 치사돌연변이 (lethal mutation) 조건 돌연변이 (conditional mutation)
산업미생물학 치사돌연변이 (lethal mutation) 조건 돌연변이 (conditional mutation) 온도 감수성 돌연변이 (temperature sensitive mutation, ts) 조건 치사 돌연변이 (conditional lethal mutation) 복귀돌연변이 (back mutation, reversion) . 야생형 –(돌연변이)→ 돌연변이주 –(돌연변이)→ 복귀돌연변이주 . 복귀돌연변이주 (revertant) : 야생형과 표현형이 같음 . 점돌연변이 : 복귀돌연변이가 비교적 쉽게 일어남 틀 밀림 돌연변이 : 복귀돌연변이가 일어나기 어려움

13 돌연변이 (Mutagenesis) 자연돌연변이 (Spontaneous mutation)
산업미생물학 돌연변이 (Mutagenesis) 자연돌연변이 (Spontaneous mutation) Endogenous process : free radical mistake during replication mutator gene Exogenous process 빈도 낮음 (low frequency) 인공돌연변이 (Artificial, Induced mutation) 돌연변이 유도제 (Mutagen, Mutagenic agent)

14 돌연변이 유도 (Mutagenesis) 물리적 (Physical Mutagenesis)
산업미생물학 돌연변이 유도 (Mutagenesis) 물리적 (Physical Mutagenesis) Ultraviolet ray (UV), … 화학적 (Chemical Mutagenesis) Nitrosoguanidine (NTG), … 생물학적 (Biological Mutagenesis) Transposon (Tn), …

15 Physical Mutagenesis 비이온화 방사선 (Non-ionizing radiation)
산업미생물학 Physical Mutagenesis 비이온화 방사선 (Non-ionizing radiation) 자외선 (Ultraviolet ray, UV) 이온화 방사선 (Ionizing radiation) : free radical 형성 X-ray, γ-ray, β-ray 미생물의 돌연변이 유도에는 사용하지 않음 : 에너지가 너무 크다.

16 자외선 (Ultraviolet ray) Non-ionizing radiation 미생물 돌연변이 유도에 가장 많이 사용됨
산업미생물학 자외선 (Ultraviolet ray) Non-ionizing radiation 미생물 돌연변이 유도에 가장 많이 사용됨 짧은 파장이 효과 큼 (200 ~ 300 ㎚, λmax = 254 nm) λmax (maximum absorption wavelength, 최대흡수파장) 피리미딘 이량체(pyrimidine dimer) 형성 : Thymine dimer T-T, T-C, C-C intra-strand, inter-strand

17 The Fate of Pyrimidine dimers
산업미생물학 The Fate of Pyrimidine dimers Error-free DNA repair ⇒ No mutation 제거수복 (Excision repair) Nuclease DNA polymerase DNA ligase * Caffeine : 제거수복 억제 광부활현상 (Photoreactivation) Photolyase CPD (cyclobutane pyrimidine dimer) photolyase Some sunscreens include photolyase Visible light (> 300 nm) Error-prone DNA repair ⇒ Mutation SOS repair

18 제거 수복 (Excision Repair)
산업미생물학 제거 수복 (Excision Repair)

19 광부활 (Photoreactivation)
산업미생물학 광부활 (Photoreactivation)

20 Chemical Mutagenesis 염기 유사물질 (Base analogs)
산업미생물학 Chemical Mutagenesis 염기 유사물질 (Base analogs) 5-bromouracil (5-BU) : analog of thymine 2-aminopurine (2-AP) : analog of guanine & adenine 알킬화제 (Alkylating agents) nitrosoguanidine (NTG) methylmethane sulfonate (MMS) ethylmethane sulfonate (EMS) 염기와 화학반응하는 물질 (chemicals reacting with DNA) nitrous acid (HNO2, 아질산) : deamination of base (A, C) hydroxylamine (NH2OH) : hydroxylation of cytosine 삽입화제 (Intercalating agent) acridine orange ethidium bromide (EtBr)

21 Nitrosoguanidine (MNNG, NTG, MNG)
산업미생물학 Nitrosoguanidine (MNNG, NTG, MNG) N-methtyl –N’-nitro-N-nitrosoguanidine Alkylation of Guanine or Thymine Guanine 또는 Thymine에 alkyl group 첨가 부정확한 DNA 복제 유도 염기치환 (Transition between GC and AT) 주로 replication fork에서 돌연변이 유도 낮은 치사율에서 높은 돌연변이율 Carcinogen : 사용에 주의 Ethyl methanesulfonate (EMS) aklylates guanidine residues Methyl methanesulfonate (EMS) aklylates guanidine and adenine residues

22 Ethidium bromide (EtBr)
산업미생물학 Ethidium bromide (EtBr) Intercalating agent (삽입화제) 크기, 모양 : 전기영동 후 DNA 염색에 주로 쓰임 사용에 주의

23 Transposon (Tn, Transposable element)
산업미생물학 Biological Mutagen Transposable element (TE, 전이성 인자, 이동 유전물질) Jumping gene : a small piece of DNA that inserts itself into another place in the genome Insertion sequence(IS), Transposon(Tn), bacteriophage Mu Transposon (Tn, Transposable element) 양쪽 끝에 삽입요소(IS, insertion sequence) 선발표지로 사용 가능한 유전자 가짐 : 항생제 저항성 유전자

24 Transposon mutagenesis (Transposition mutagenesis)
산업미생물학 Transposon mutagenesis (Transposition mutagenesis) Transposon을 염색체 상의 특정 유전자 내부에 삽입 → 유전자 기능 상실 (삽입불활성화, insertional inactivation) * plasmid에 삽입된 transposon 이용 삽입 여부는 항생제 저항성으로 판단 * 항생제 저항성 유전자는 transposon에 Advantages Much more effective than chemical mutagenesis, with a higher mutation frequency and a lower chance of killing the organism Able to induce single hit mutations Able to incorporate selectable markers in strain construction Able to recover genes after mutagenesis Disadvantages Low frequency of transposition in living systems Inaccuracy of most transposition systems

25 위치특이적 돌연변이 돌연변이 처리 (물리적, 화학적) 위치특이적 돌연변이 변이 열점 (mutation hot spot)
산업미생물학 위치특이적 돌연변이 돌연변이 처리 (물리적, 화학적) 변이 열점 (mutation hot spot) 정확한 변이 예측 안됨 : 위치, 정도, 변이 염기 위치특이적 돌연변이 Site-directed (Site-specific) mutagenesis 특정 유전자 내의 특정 염기를 치환, 삽입, 제거 방법 : Recombinant DNA (유전자 클로닝) PCR (Polymerase chain reaction) Oligonucleotide 합성 용도 : 유전형과 표현형의 관계 조사 효소의 활성부위 조사 단백질의 기능 향상 (단백질공학)

26 PCR PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)
산업미생물학 PCR PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응) DNA의 특정 영역을 복제∙증폭 · DNA 가닥의 열변성 (denaturation step) · 프라이머와 annealing (annealing step) · DNA polymerase에 의한 DNA 합성 신장 (extension step) 을 반복하여 실시함으로써 in vitro에서 DNA를 증폭하는 방법이다 Template DNA Primer set (forward & backward primer) DNA polymerase : heat resistant Taq polymerase dNTP : dATP, dTTP, dGTP, dCTP buffer

27 Error-prone PCR Random Mutagenesis by Error-prone PCR
산업미생물학 Error-prone PCR Random Mutagenesis by Error-prone PCR “sloppy” version of PCR a fairly high error rate of replication (up to 2%) 방법 increase the MgCl2 add MnCl2 use unequal concentrations of each nucleotide After error-prone PCR, the mutant coding sequences must be cloned into a suitable plasmid

28 돌연변이 처리 돌연변이처리-선발 프로그램 (Mutation-Screening Program) Automated screen
산업미생물학 돌연변이 처리 돌연변이처리-선발 프로그램 (Mutation-Screening Program) 작은 변이로 여러 단계에 걸쳐 생산성 향상 Mutation - Major mutation Minor mutation : 산업용 균주의 육종에 사용 한 단계에서 생산성 향상 균주 선발 후 다음 단계 처리에 사용 1. 돌연변이 유도 (선발된 균주 사용) 2. 생존 균주의 발효 실험 (small scale) 3. 향상된 균주 선발, 다음 단계의 parent strain으로 사용 가능하면 각 단계에서 서로 다른 유도 방법 사용 Automated screen

29 돌연변이 처리의 최적화 돌연변이 처리의 최적화 (Optimization of Mutagenesis) Parent strain
산업미생물학 돌연변이 처리의 최적화 돌연변이 처리의 최적화 (Optimization of Mutagenesis) Parent strain Mutagen Dose Conditions of treatment Screening method 돌연변이 처리 효과 미생물 균주의 종류 및 상태 돌연변이 유도제의 종류 및 처리 조건 돌연변이주 선발 방법

30 미생물 균주의 종류 및 상태 Parent culture 목적물질 생산성 종류 및 상태
산업미생물학 미생물 균주의 종류 및 상태 Parent culture 목적물질 생산성 종류 및 상태 미생물의 종류에 따라 DNA 수복 기능이 다름 성장단계 및 상태에 따라 민감성이 다름 가장 민감한 상태의 세포를 돌연변이 처리에 사용 단세포/단핵이 유리

31 돌연변이 유도제의 종류 및 처리 조건 돌연변이 유도제의 종류 유도제에 따라 일으키는 변이의 종류 및 위치가 다름
산업미생물학 돌연변이 유도제의 종류 및 처리 조건 돌연변이 유도제의 종류 유도제에 따라 일으키는 변이의 종류 및 위치가 다름 transition, transversion, deletion, insertion hot spot (변이 열점) : NTG – replication fork 처리의 농도/강도, 처리 시간, pH, 완충용액 (현탁액) DNA repair 저해/향상 UV mutagenesis caffeine : error-free excision repair 저해 visible light : error-free photoreactivation 유도

32 최적 처리 조건 예측 : Dose-Response curve (처리 정도 vs. 생존율)
산업미생물학 최적 처리 조건 예측 : Dose-Response curve (처리 정도 vs. 생존율) Micromonospora inyoensis를 아질산으로 처리 * 생존율 : 10%? * 변이 효율 : mutants/survivors

33 돌연변이주의 선발 임의선발법 (Random screening) 선택적 선발법 (Selective screening)
산업미생물학 돌연변이주의 선발 임의선발법 (Random screening) 처리 후 모든 생존 균주 배양 각 균주의 형질 조사 선발 대상 돌연변이주의 수 ? 선택적 선발법 (Selective screening) 선발 대상 돌연변이주의 수를 줄이기 위해 처리 후 특정 돌연변이주만 증식하도록 배양 돌연변이주 중 원하는 형질 가진 균주 선발 * Enrichment : application of special environmental conditions, toxic to a majority of cell type but less or nontoxic to a desired minority of cells 왜 가능?

34 돌연변이 형질의 발현 돌연변이 형질의 발현 분리지연 (segregation lag) 표현지연 (phenotypic lag)
산업미생물학 돌연변이 형질의 발현 돌연변이 형질의 발현 돌연변이 유도 염기서열의 변화 분리 (Segregation) : Genotype 변이된 유전자에 의한 형질 발현 : Phenotype 분리지연 (segregation lag) 이유 : DNA : double helix 진핵생물 : 상동 염색체 복제 과정 : 분열 전 다음을 위한 복제 진행 표현지연 (phenotypic lag) 표현형질의 발현 : 단백질 (효소) 단백질 : 반감기 돌연변이주의 선발은 분리지연과 표현지연 현상 고려

35 Enrichment Procedures
산업미생물학 Enrichment Procedures 물질의 생합성 대사경로 (Metabolic pathway) - 가지달린 대사경로 (branched metabolic pathway) 대사조절 (Metabolic control, Metabolic coordination) Overproducer 조절 돌연변이주 (Deregulated mutant) 영양요구 돌연변이주 (Auxotrophic mutant)

36 Enrichment for deregulated mutant
산업미생물학 Enrichment for deregulated mutant 대사산물의 유사물질 (analogs of amino acids, vitamins, …) 대사산물과 유사한 구조를 가졌으나 생존∙증식에 사용되지 못함 대사산물과 유사한 구조를 가져 대사조절작용을 함 Wild type : 정상 대사경로 & 대사조절, sensitive to analog analog 흡수 → analog는 증식에는 이용되지 못함 → analog에 의한 대사조절작용 : 대사산물 합성 불가 → 세포 사멸 Deregulated mutant : 대사경로 변형, resistant to analog analog 흡수 → analog는 증식에 이용되지 못함 → 대사조절 변이 : analog 존재하에서도 대사산물 합성 → 세포 증식 Antibiotic resistant mutant

37 Enrichment for auxotrophic mutants
산업미생물학 Enrichment for auxotrophic mutants 페니실린 농축법 (Penicillin enrichment) 복제평판법 (Replica plating) 여과농축 배양법 (Filtration enrichment)

38 Penicillin enrichment
산업미생물학 Penicillin enrichment

39 세균의 세포벽 형성 저해 : peptidoglycan, crosslink 형성 증식하지 않는 세포는 저해하지 않음
산업미생물학 페니실린 농축법 (Penicillin Enrichment) Penicillin : 세균의 세포벽 형성 저해 : peptidoglycan, crosslink 형성 증식하지 않는 세포는 저해하지 않음 영양요구 돌연변이주 (auxotrophic mutant) 선발 Procedure 돌연변이 처리 요구하는 영양소가 결핍된 배지에 배양 : 합성배지 원영양균 : 증식 영양요구 돌연변이주 : 증식 못함 Penicillin 첨가 원영양균 : 증식 → 사멸 영양요구 돌연변이주 : 생존 Penicillin 제거 : Penicillinase 첨가 요구하는 영양소 포함 배지에 배양 생존한 영양요구균 : 증식

40 Replica Plating 산업미생물학

41 복제평판법 (Replica plating)
산업미생물학 복제평판법 (Replica plating) 영양요구 돌연변이주 (auxotrophic mutant) 선발 Procedure 돌연변이 처리 고체 복합배지에 배양 모든 생존 균주 (원영양균 + 영양요구 돌연변이주) 집락 형성 집락을 특정 영양소 결핍 고체 배지에 배양 : 복제평판배양, Toothpick method 원영양균 : 증식 → 집락 형성 영양요구 돌연변이주 : 증식 못함 복합배지에서는 증식하나 영양소 결핍 배지에서 증식 못하는 균주 선발

42 여과 집적 배양법 여과집적배양법 (Filtration Enrichment) 사상균 : 곰팡이, 방선균 등 균사로 성장하는 균
산업미생물학 여과 집적 배양법 여과집적배양법 (Filtration Enrichment) 사상균 : 곰팡이, 방선균 등 균사로 성장하는 균 Procedure 포자를 돌연변이 처리 영양결핍배지에서 배양 원영양균 - 증식, 균사 형성 영양요구 돌연변이주 – 생존, 증식하지 않음 (포자) 여과 원영양균 : 여과막 통과 못함 영양요구 돌연변이주 : 포자 여과 여과액을 영양소 함유 배지에 배양 영양요구 돌연변이주 : 증식 복제평판법으로 확인


Download ppt "균주 개량 Strain Development"

Similar presentations


Ads by Google