▣ 세균의 배양과 동정 1. 검사재료의 채취, 보존 및 검체에 따른 배지선택에 대하여 설명한다.

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1 ▣ 세균의 배양과 동정 1. 검사재료의 채취, 보존 및 검체에 따른 배지선택에 대하여 설명한다.
2. 세균의 배양법에 대하여 설명한다. 3. 세균의 기본 염색법을 설명한다(그람염색, 항산성염색). 4. 세균의 획선배양(접종)법(streaking)을 설명한다. 5. 검체로부터 세균을 분리 배양하여 집락을 관찰한다.

2 ▣ 배지 (Medium) 세균증식에 필요한 영양소를 적당히 혼합하여 적절한 물리화학적 환경을
인공적으로 만들어 세균증식에 이용하는 것. 세균을 인공배지에 잘 배양하기 위해서 세균의 영양 및 물리적 요구사항을 알아야 한다. 적절한 배지를 사용하기 위한 세균의 중요한 요소 1) 영양소를 고르게 2) 절절한 산소의 요구 3) 습도 유지 4) 배지의 적절한 반응 5) 적절한 온도 반응 6) 배지 반드시 살균 7) 오염 반드시 막아야함

3 ▣ 물리적 성산에 의한 배지 종류 ◇ 배양기 또는 배지 - 미생물 생장에 필요한 모든 영양성분이 들어있는 것
- 필요 이상의 영양분 →미생물 성장에 억제 효과 - 배양 목적에 따라 →한천(agar)이나 젤라틴(gelatin) 첨가 →고체배지 1) 액체배지 영양소를 증류수에 녹여, 시험관에 분주한 액화된 배지 일반증식용, 균의 대량배양, 대사산물 획득 2) 고체배지 액체배지에 한천(agar), 젤라틴(gelatin) 등을 첨가하여 고형화 시킨 배지 % agar, 혹은 젤라틴, 달걀 알부민 또는 혈청의 순수한 배양 또 는 균주 보존용으로 사용 가) 평판배지(agar plate) 나) 사면배지(agar slant) 다) 반사면 또는 반고체 배지 라) 고층배지 : 천자배양 3) 반고체 배지 고체배지 보다 응고제의 농도를 낮추어 만든 배지로, 운동성 검사나 균주 보관에 이용. 0.5% agar, 운동성 실험 (SIM 배지)

4 ▣ 배지의 사용목적에 따른 구분 1) 증식 배지(Enrichment medium)
- 여러 미생물이 있을 경우 원하는 미생물의 증식에 도모하는 영양분을 넣어주는 배지 - 병원성 세균에서 배지에 혈액을 넣어줌으로(blood nutrient medium) 병원성 세균의 활발한 증식 도모 2) 영양첨가배지(Enriched medium) - 특정세균만을 잘 성장하도록 혈액, 성장인자 같은 복잡한 유기물을 넣은 배지 - 혈액한천배지, 초코렛한천배지 등이 있음. 3) 선택배지(Selective medium) - 특정한 미생물 성장을 도모 → 원하는 미생물만 선택적으로 배양하는데 사용하는 배지 Salmonella-Shigella 배지, MacConkey agar, Telluite 첨가배지 4) 감별배지(Differential medium) 배지에 특수한 생화학적 지시약을 넣어줌으로써 한 종의 미생물을 다른 것으로 부터 구별할 수 있게 하는 배지 - Eosine-methylene blue(EMB) 영양배지: 유당(lactose) 발효하여 산을 내는 균 → 금속성의 광택있는 집락(유당 발효 X 균과 구별) * EMB 배지: Peptone 10 g, K2HPO4 2 g, Agar 15 g, Eosine Y 0.4 g, Methylene blue g/1 L → 장내세균 검정: lactose 10 g 첨가, 대장균, salmonella 영양요구성 돌연변이 이용 유전자 전달 시험: yeast extract 5 g 첨가, 세균의 phage 감수성 실험: 당 첨가 X

5 ▣ 배지의 사용목적에 따른 구분 5) 성상확인 배지 (Identification media)
순수배양된 세균의 균종 감별에 사용되는 배지 지시약: 균의 생화학적 성상에 따라 구분됨 eg. SIM medium = H2S , iron , indole , motility tests for Salmonella and Shigella, urea agar or broth = for Proteus, phenol red 6) 환원배지(Reducing medium) - 배지 내에 산소를 흡수하거나, 산소 침투를 느리게 하는 물질을 이용, 혐기성 세 균 여부를 결정하는데 이용 7) 수송배지(Transport medium) 원거리로 검체를 옮길 때에, 세균이 사멸하지 않고 유지 할 수 있도록 고안된 배지 thioglycollate medium ※ 모든 배지는 배양방법, 배양환경에 따라 배양 효과가 달라짐

6 ▣ 주로 이용되는 배지성분 탄소 그리고 에너지원으로 역할을 하고 게다가 인산의 중요한 원천으로써 아미노산의 혼합물.
A) 펩톤 탄소 그리고 에너지원으로 역할을 하고 게다가 인산의 중요한 원천으로써 아미노산의 혼합물. - 단백질을 펩신, 트립신으로 소화 시켜 만든 것 B) 쇠고기 추출물 - 염류, 비타민, 핵산물질, 당분, 아미노산, 단백질의 보급원. - 무산소배지에는 환원물질이 많은 간, 뇌, 신장 추출물을 많이 이용 C) 효모 추출물 - 효모에서 추출한 수용성 추출물로써 쇠고기 추출물과 유사한 역할. D) agar 해초, 조류에서 추출한 함수탄소 탄수화물의 일종으로 폴리사칼라이드 (polysacchride)이다. 용해점 : 100℃, 영양분은 없음, 배지의 고용화 E) 젤라틴 동물의 피부, 뼈, 건을 끓여서 그 액체를 건조시킨 황갈색 분말입자, 아교 라고도 함, 용해온도가 37℃ 이하 이므로 고형배지에 부적합 - 젤라티네이스(gelatinase) 생산 검정에 이용.

7 ▣ 접종 된 배양배지의 배양 배양시 공기조성에 따른 분류 1) 호기성 배양법 ; 37℃ - 대부분 병원균
25-30℃(저온배양) - 곰팡이, 항산균 2) 탄산가스 배양법 ; 호기성 배양법의 일종, 촛불병 배양법 - 건조기 내부의 촛불이 스스로 꺼지면 탄산가스 함량은 3-5%. - Haemophylus, Brucella, Neisseria gonorrhoeae 배양 혐기성 배양법 ; 산화 환원 전위차를 낮춤, 혐기성 균배양조를 이용하여 산소 차단

8 ▣ 배양 방법 A) 획선 평판 배양법 시료 → 백금이 → 평면 한천 → colony 무리 → 새로운 배지에서 순수 배양 B) 평판 희석 배양법 참조 ; 물, 우유, 하수에 들어 있는 세균성 세포를 계산하는 방법 C) 순수 배양 방법과 보관 방법 - 순수 배양을 위한 평면 한천 배양 사용 - 보관하기 위해 사면 배지 사용; 사면 배지에 바른다. → 37℃, 18-24시간 배양 → 5-10℃ 보관; 1개월마다 1회씩 확인 요망. - 고층배양; 천자 배양 → 37℃, 18-24시간 배양 → 상층에 소독한 액체 파라핀 중첩 → 5-10℃ 보관, 1-수개월 보관 가능

9 ▣ 미생물 검사실의 검사 절차 ◇ 환자의 몸에서 채취한 검체는, 오염을 방지하여 첫 번째로 배양을 하여야 하며, 배양 후 남은 검체로 도말표본을 하여 관찰. 1. 도말 표본 1) 그람염색(gram staining) 2) 항산성염색(acid fast staining) 3) 기타 특수염색(flagella, capsule, endospore staining) 2. 배양 검사 1) 증균배양, 분리배양(선택배지, 감별배지), 혐기성 배양 2) 관찰 및 동정검사 3) 약제 감수성 검사 4) 검사 결과 보고 * 동정(identification) 방법 - 염색 후 형태 관찰: 균의 배열관계 및 포자 형성 여부 등 - 집락(colony) 관찰(colony shape, color motility 등) - 생화학적 검사: fermentation, nutritional requirement, 독소 생산 능력 등 - 혈청학적 검사: 항체를 이용한 분류 아형(subtypes) 또는 변종(variants) 구분 - 분자생물학적 검사(Molecular Diagnostics): DNA염기 조성에 따른, 유전학적인 차이로 세균의 감별 3. 결과 보고까지의 검사소요 시간 1) 그람염색(gram staining): 20~30분 2) 검체의 동정 검사: 2~3일 3) 호기성균의 약제 감수성 검사: 3~4일 4) 혐기성균의 동정검사 및 약제 감수성 검사: 6~9일