6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 시료 채취 2. 총균수 측정(직접현미경 계수법)

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1 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 시료 채취 2. 총균수 측정(직접현미경 계수법)
☞ 우유 및 유제품의 위생적 품질 측정의 방법으로 미생물 검사 - 대상 : 총균수, 생균수, 대장균군, 병원성 세균 검사 시료 채취 - 충분한 혼합 - duplicate sampling - 날자, 시간, 장소, lot 번호 명기 - 샘플 채취 후 5℃ 보관 - 샘플 채취 후 24시간 내 검사 2. 총균수 측정(직접현미경 계수법) - 세균(생균+사균) 검사 - 정확성 낮으나 신속함 - 1cm2 구획 내에서 관찰 (breed slide 이용) - sample 고정 -> 지방제거 -> 염색 -> count - 현미경시야 20군데 이상 count - 세균덩어리 : 1개로 count - 세균이외의 다른 세포도 count ☞ 세균계수법 (세균수/ml) ① 현미경시야 넓이 계산(slide micrometer 이용) ② 현미경시야당 평균세균수 = 전체세균 / 현미경 시야수 ③ 1cm2 당 현미경시야수 = 1cm2 / 현미경 시야면적 -> calculation (cells/ml) = ② x ③ x DF

2 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 3. 생균수 측정 1) SPC (standard plate count)
- spc agar 에서 colony 형성 CFU count -> 적정 희석 필요 - dilution solution -> KH2 PO4 buffer (pH 7.2) 0.25M - 배지 spc agar medium - tryptone(0.5%) : digested casein - yeast extract(0,25%) – nitrogen source - glucose(0.1%) : carbon source - agar (1~1.5%) : solidifying agent ☞ Procedure A. dilution by 10 fold or 100 fold 1 ml + 99ml -> 10-2 1 ml + 9ml -> 10-3 - B. add sample to plate C. add and mix agar soln D. incubate 72 hr at 30℃ E. colony count - incubation 완료 후 즉시 혹은 4℃에서 24시간 내 ☞ agar medium - 44 ~ 46℃, 10 ~ 12ml 사용 - 제조 후 3시간 내에 사용 - dilution -> agar 더하기 : 20분이내에

3 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 2) 저온세균(PBC) - spc와 동일한 방법
- 7℃, 10 일 or 25℃, 72시간 배양 - 배지온도 45℃ 이하에서 사용 3) 호열성세균(thermophilic) - 55℃, 48시간 배양 - 수분증발방지 -> parafilm sealing 4) 내열성(thermoduric) - 63℃, 30분 살균 후(in water bath) spc와 동일한 방법으로 30℃에서 count 5) 산생성균(유산균) - BCP(bromo cresol purple) ~ % 첨가한 SPC 배지 사용 - 35 ~ 37℃, 72시간 배양 -> 황색 colony count 6) 단백분해균 - 10% 탈지유 혼합 SPC 배지 사용 -> 균일한 탁도 유지 - 35 ~ 37℃ or 20 ~ 22℃(butter, cheese), 시간 - colony 주변 clear zone 형성 -> 양성 7) 지방분해균 : spirit blue agar, Rhodamine 6G 이용 8) 효모 및 곰팡이 - 총균수 : 현미경으로 직접 측정 - 생균수 측정 -> PGA(potato glucose agar)배지 이용 세균의 SPC 와 동일한 방법으로 측정 9) 병원성균 및 기타세균 : selective 배지 혹은 미생물에 따른 특정의 배양조건에서 배양 후 균수 측정

4 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 ☞ spc counting 방법

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7 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 ☞ spc counting 방법

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11 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 4. 대장균군 (coliform bacteria) - Gram –
- no spore, rod shape - 유당분해 -> 가스 생성 - 환경위생의 지표균 - 60℃, 15 – 20분 가열 -> 일반적으로 사멸 -> 우유처리과정의 위생성검사에 이용 - 추정시험 -> 확정시험 -> 완전시험으로 구분 A. 추정시험 - 액체배지 : BGLB(Brilliant Green Lactose Broth) - 2% BGLB 배지에 0.1 – 1ml 접종 - 35℃, 48시간 배양 후 -> gas 생성 -> 추정시험 양성 -> 다음 단계로 - 고체배지 : deoxycholate agar, violet red bile agar 이용 - 35℃, 20시간 배양 -> 0.5mm 이상 암적색 colony -> 양성 -> cfu/ml 결정 B. 확정시험 - BGLB 배지에서 gas 형성 시 - EMB(Eosine Methylene Blue), Endo 배지이용 colony 형성 - 전형적 대장균 colony -> 확정시험 양성 -> 완전시험으로 - 아전형적 colony 형성 -> 완전시험으로 - 음성집락 -> 음성 C. 완전시험 - 확정시험의 EMB, Endo 배지에서 아전형적 colony 형성 시 - colony sample 이용 유당 bouillon 발효관에서 개스생성여부 확인 -> 양성 - 양성의 경우 -> 그람음성, 무포자 확인 -> 완전시험 양성

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14 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 □ 원유 및 유제품에서의 미생물학적 위해요소(HACCP)
Severe Moderate Moderate (Extensive spread) (Limited spread) Brucella Salmonella spp S. aureus L. monocytogenes E. coli O157:H Y. enterocolitica Shigella spp Cl. perfringens C. jejuni B. cereus

15 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 □ 우리나라의 유가공품에 대한 미생물기준 (축산물의 가공기준 및 성분규격, 농림부고시)
□ 우리나라의 유가공품에 대한 미생물기준 (축산물의 가공기준 및 성분규격, 농림부고시) 우유류 세균수 : 1ml당 20,000 이하(멸균제품의 경우 55℃, 또는 37℃에서 2주간 보관 후 표준평판법에 의할 때 음성이어야 한다) 대장균군 : 1ml당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다) 유산균수 : 1ml당 1,000,000이상(단, 유산균 첨가제품에 한한다)

16 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 □ 우리나라 원유의 위생등급 분포

17 6. 우유 및 유제품의 미생물학적 시험 ○ 제조물책임법(Product Liability) 실시 (2002.7.1)
○ 우유류 유통기한 자율화 ( ) ○ HACCP제도 정착 (인증유가공장수 : 27개) □ 우유류 유통기간 자율화배경( ) 원유위생관리의 향상으로 원유의 병원성 미생물의 오염이 감소되고, 1등급 원유가 90%이상을 차지 우유류 제조업체 생산시스템의 자동화체제로의 전환에 따른 철저한 위생관리 Cold chain system 도입으로 유통시스템의 혁명 우유 생산제조업체의 기술수준 향상으로 품질관리에 만전