DNA microarray를 이용한 유전자 differential expression 정량측정 실험

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1 DNA microarray를 이용한 유전자 differential expression 정량측정 실험
생명과학 /바이오 융합 연계전공 한다혜

2 Out line Abstract Method & Theory Data & discussion Result Reference
Central dogma ,DNA 구조, PCR, hybridization Data & discussion Result Reference

3 실험 목적 실험 개요 DNA chip Sample Hybridization → 형광 발현
High-througtout 방법인 DNA chip을 이용하여 조건에 따라 달리 발현되는 세포 내 유전자상의 DNA조각들을 일정한 간격으로 붙이고 형광물질로 표지 한 유전자 cDNA (RNA) or DNA의 hybridization을 통해 발현 양상을 정량적으로 분석 실험 개요 DNA chip Sample Hybridization → 형광 발현

4 실험방법 DNA Chip 제작 Sample 제작 RNA 추출 Reverse transcription
Primer 설계 좋은 primer의 조건 PCR Electrophoresis Purification Elution chip 제작 RNA 추출 Purification Reverse transcription Amino Allyl Labeling Cy3/ Cy5

5 DNA chip 제작 DNA 추출과 primer제작 병원성 유전자
- S. typ, S. flex, E. coli, V. vul, V.cho, V. par Primer 설계 - 좋은 primer 의 조건 앞/ 뒤 primer의 Tm값 비슷하게 GC의 함유량은 40~60% Self complimentary, hetero dimer 생성 방지

6 ATG GAT TTG CGC ATT AGC GG 56.5 CAG TGA CAT TCG AGG TCT GC 55.7 250
1 FlgE ATG GAT TTG CGC ATT AGC GG 56.5 CAG TGA CAT TCG AGG TCT GC 55.7 250 2 VenB ATG CCA TCG CGG ATT TTA CT 54.9 CCA TTT TTC CAC CAA CAC CA 53.7 251 3 FliP ACT TCT GAC CAC GTT TTG GC 55.9 AGT AGT CTT CAC TGC CGT CA 55.5 236 4 Wzb TGA GCG TGT GCT ACA AAA A 52.5 GTT AGT GCT TCC ATA TGG C 50.8 228 5 hemolysin CAG TCA ATA TAG TGT GCG CG GCA CTG TGG TCA AAG GTT TT 53.9 246 6 RtxA GTA AAA TCA GAG CGA GAG CC 53.3 CTG ATG CTC AAC GGC AAT AT 53.1 249 7 VvhA CAA AGT AGG CGC GGA AGT GA 57.7 CAA ATA CCC AAC CAC TGC CC 245 8 VvhB TGC TGT TTG TTT GCG GCG AA 58.8 GCG TCG TCA CCA GCA ATT TG 57.4 248 9 VvhD TGA ACG CGG CGT GCT TAA TG 58.9 GCG GCG ATC AAC ACC AAA GT 58.7 244 10 VvhE-1 GTC GAT GCC CAT TTC TTT GC GTC GGT CAA TCC GTG TGA AA 55.3 11 VvhE-2 GAT TCA ACT GCC GAA TGG CA 56.1 GAG CGC TTT AGC ATT GGC AT 56.4 241

7 PCR 1. Denaturation 2. Annealing –Taq Polymerase 3. Elongation

8 Sample 제작 V. vnl의 RNA 추출 - RNA 다룰 때 유의사항 Reverse transcription
Amino Allyl Labeling - DNA : Cy3(녹색), RNA : Cy5(붉은색) Multiplex-PCR

9 Central dogma

10 Hybridization

11 실험 결과

12 결과 분석 & 토의 발현 양상 Positive control과 비교 2nd line 에서 RNA 발현
Trouble shooting Edge drying Comet High background

13 결론 DNA hybridization을 통해 어떤 균이 실제로 있는지 알 수 있고 RNA (cDNA) hybridization을 통해 어떤 gene이 turn on 되었는지도 알 수 있다. Spot의 밝기를 정량적으로 분석한다면 발현의 정도 역시 정량적으로 분석가능하나 이번 실험에서는 다른 spot들과의 비교를 통해 발현의 정도를 알아보았다.

14 Reference Molecular Biology of The Gene, Watson 외 5명, 4tyh, Benjamin cummings, pp97~111 The cell, Geoffery M.Cooper 외 1명, 3rd, ASM press, p4, 8 pp29~31, 95~96, 115~116 생명과학, 김명원 외 4명, 4th, 라이사이언스, p202,209 pp161~171 Molecular cloning mannual –DNA Microarray, David Bowtell and Josep sanbrock Baldi, P. and Hatfield G. W. DNA microarray and Gene Expression, Cambridge University Express, 2002