미생물학 실험.

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1 미생물학 실험

2 LB배지 Luria Bertani media 구성요소 Tryptone Yeast extract NaCl Agar D.W

3 Media 배지란 눈에 보이지 않는 생물 이나 세포의 생존, 성장에 필요한 영양소가 함유된 물질을 말한다.
배지란 눈에 보이지 않는 생물 이나 세포의 생존, 성장에 필요한 영양소가 함유된 물질을 말한다. 탄소원, 질소원, 무기염류, 비타민류, 등을 공급한다. 액체배지와 고체배지가 존재 하며 현탁 배양법 과 고체배지 배양법 등이 사용된다. 현탁 배양법: 증균 및 대사산물의 생산 등에 이용 고체 배양법: 세균 보존 및 분리에 사용 주의 사항 오염 가능성을 최소화 한다! 더러운 손(X), 기침(X), 잡담(X)

4 Agar Gelatin 형태로 홍조류 로 부터 유래되었다.
한천원조와 조류세포 의 구조를 지지하는 cell wall의 축적물 이다. 조류의 혼합물 Agarose 와 Agaropectin등이 존재 한다.

5 Autoclave Autoclave는 멸균 하는데 사용하는 기계장치로 써 고온 고압의 의한 미 생물 비활성 시키는데 목적이 있다. 일반적으로 고압력 121℃ 에서 15~20분간 사용한다.

6 History 1697년 Denis Papin이 개 발한 Steam digester로 부 터 유래되어
1879년 Charles Chamberland에 의해 발 명되었다. 미생물학, 의학, 균류학, 치의학, 수의학, 등에 이용 된다.

7 다양한 멸균 방법 화염멸균 ( Sterilization by open fire ) - 미생물의 접종 및 도말할 때 사용되는 백금이와 유리 도말기 또는 시험관이나 플라스크의 입구부분을 불꽃에 직접 접 촉하는 멸균 방법이다. 건열멸균 ( Sterilization by dry heat ) - 유리기구 등과 같이 고온에 안전한 물체 를 멸균할 때 사용하는 방법으로, 대상물체를 오븐에 넣고 170℃에서 90분간 넣 어 두는 방법 습열멸균 ( Sterilization by moist heat ) - 배양배지 같은 용액들을 멸균하는데 사용되며 보통 autoclave를 사용한다. 여과멸균 ( Sterilization by filtration ) - 열에 약하여 열을 가했을 때 파괴되거나 변질되는 용액들의 멸균에 많이 사용되며 pore size가 0.2㎛정도 되는 여과막을 통과시킴으로써 용액 안의 미생물을 분리 제거하는 방법이다. 자외선멸균 ( Sterilizatioin by UV irradiation ) - 200～380nm의 파장을 갖는 빛 을 자외선이라 하는데, 그 중 살균력을 갖는 254nm 파장을 이용한다.

8 미생물학 실험

9 미생물 순수 분리 및 배양-1 실험목표 미생물 순수 분리 및 배양 방법을 통해 원하는 균을 순 수 분리 및 배양 할 수 있다.

10 다른 종류의 생명체가 섞여있지 않는 단일 종의 집 단이 있는 상태 자연상태 → 단일 종의 미생물 얻기 위해
미생물 순수 분리 및 배양이란? 순수배양의 필요성 특정 미생물의 기본 형태, 구조, 영양 요구조건, 성장에 적합한 환경, 대사산물, 다른 미생물과의 상호관계 및 병 원성 등을 알 기 위해 순수배양의 정의 다른 종류의 생명체가 섞여있지 않는 단일 종의 집 단이 있는 상태 자연상태 → 단일 종의 미생물 얻기 위해 적절한 환경에서 다른 미생물의 오염 없이 배양

11 순수 분리 및 배양방법 미생물 순수 분리 및 배양이란?
시험관, 플라스크, 평판 배양접시(petri dish) 등의 작은 용 기를 사용 무균 상태의 용기 필요 목적한 미생물 외에는 어느 생명체도 용기 내부에 오염되 지 않게 하는 것이 중요 접종균 : 배양용기에 접종되는 미생물체 접종 도구 : 멸균된 백금이(loop)나 피펫 이용

12 검체를 최종 희석액 1ml에 한 개의 미생물이 있도록 회석 고체 배지 위 → 독립된 집락 형성(보편적인 방법)
미생물 순수 분리 및 배양이란? 미생물의 순수 분리 검체를 최종 희석액 1ml에 한 개의 미생물이 있도록 회석 고체 배지 위 → 독립된 집락 형성(보편적인 방법) 집락(colony) : 고체 배지 위에 한 종류의 미생물만으 로 형성된, 육안으로 관찰이 가능한 크기의 미생물 모임 세균집락의 형태: 육안으로 관찰한 세균 집락의 다 양한 모습. 위에서 관찰하면 집락의 전체적인 모습 과 가장자리 형태를 관찰 할 수 있고 집락의 돌출정 도나 돌출양상은 측면에서 관찰

13 세포 집락을 주사 현미경으로 촬영한 모습 Micrococcus(x31,000) (b) Clostridium(x12,000) (c) Mycoplasma pneumoniae(x26,000 (d) Escherichia coli(x14,000)

14 미생물 순수 분리 및 배양이란? 고체평판배지를 사용하는 미생물의 순수분리 방법
도말 평판법(streak plate method) 획선 평판법, 멸균된 백금이에 분리하고자 하는 미생물의 시료를 묻혀 고체 배지의 한쪽에서부터 시작하여 점진적으로 도말 도말 하는 방법: 한쪽에서 점진적으로 도말 주입평판법(pour plate method) 혼합평판법, 시료를 연속적으로 희석한 후 시료의 일부를 액상의 고체배지 에 섞은 다음 평판접시에 함께 부어 고화시킨 뒤 배양 배지표면 뿐만 아니라 내부에도 집락 생성 표편도말법(spread plate method) 미생물이 함유된 한 방울의 현탁액을 고체배지 위에 멸균된 유리막대로 펼 치는 방법 집락이 충분히 분리되어 성장하기 위해 현탁액을 미리 회석 배양 후 분리 된 집락을 새로운 배지에 접송 → 순수성 확실

15 Streaking 미생물의 single colony를 얻기 위한 도말 법 중 하나
Inoculation된 loop나 stick 을 이용하여 streak하여 isolation함 Single colony에서 순수 분리에 많이 사용됨

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17 조별로 LB agar 배지 만들기 개인당 4개의 LB agar 배지를 만든다.
1개 plate 약 25 ml 들어갈 수 있게 조별로 배지를 만든다. (한 조 5명 기준 LB agar 배지 500 ml 만든다.) Tryptone g Yeast extract g NaCl g Agar g 증류수 ml

18 순수분리 한 균주 특성 알아보기

19 1. Gram staining

20 Gram simple staining 그람 양성 세균과 음성 세균 구분된다. 그람 양성 음성 세균은 세포벽 구조가 다르다.
그람 양성 세균과 음성 세균 구분된다. 그람 양성 음성 세균은 세포벽 구조가 다르다. Staining dye로 염색한 후 에탄올을 처리하면 그람 음성세균은 탈색이 일어나는데 반해 그람 양성 세균은 이러한 탈색이 일어나지 않는다.

21 2. Genomic DNA 추출

22 개요 주변 토양, 액체시료 키운 미생물 확인 액체배지 미생물 접종 M. smegmatis Genomic DNA 추출
Streaking을 이용한 E.coli single colony 순수 분리

23 Genomic DNA란? 생물체가 생존하기 위 해 필요한 모든 유전정 보를 담고있는 DNA
Gene과 non-coding sequence DNA, RNA를 모두 포함 함

24 Why ? E. coli ? 내가 채취한 샘플은 왜? E.coli는 왜? 병원성 미생물일 경우
ex) Mycobacterium tuberculosis 그리고… 그 위험성 E.coli는 왜? 안전성이 검증된 균주 ex) Mycobacterium smegmatis

25 Mycobacterium tuberculosis
성장에 높은 농도의 산 소를 요구함 세포 표면에 왁스 코팅 을 하고 있어 그람 염색 이 스며들지 않음

26 결핵 결핵균은 1882년 미생물학자 인 Robert Koch에 의해 발견 됨
수천 년 동안 인류에 질병을 일으켜 왔으며 전염성이 강함 2007년에는 개발도상국 을 중 심으로 약 1,370만의 만성 질 환자가 있으며, 930만의 새로 운 환자가 발생하고, 180만이 사망한다고 추정됨 세계인구의 1/3이 결핵균에 감염되었다고 추정됨

27 Mycobacterium smegmatis
비 병원성 항산균으로 보통 남, 여 외음부 점막표면에 공생 상태로 존재함 겨드랑이, 귀지, 흙 , 물, 등 에도 다양하게 존재함 M. tuberculosis과 똑같이 3~5 ㎛의 가늘고 긴 간균으로 매우 유사함 M. smegmatis 는 결핵연구등에 서 대체 미생물로 많이 사 용됨

28 Electrophoresis ? 전기장 안에서 하전된 이온의 양극(+) 또는 음극(-) 쪽으로 이동하는 현상
전기장 안에서 하전된 이온의 양극(+) 또는 음극(-) 쪽으로 이동하는 현상 입자의 전하량, 크기, pH등에 따라 이동속도가 달라 짐 DNA, RNA, protein등 을 분리 분석에 많이 사용됨

29 3. 항생제 저항성 및 Plasmid DNA

30 항생제 저항성 1928년 여름 Alexander Fleming 휴가 에서 다녀와 푸른곰팡이가 petri- dish 위에 자라, 주변의 포도상구 균이 깨끗하게 녹아있는 모습을 발견. 페니실린은 제2차 세계대전 중에 상용화에 성공, 1943년부터 사용되기 시작함. 1944년부터는 민간에도 사용되어 수많은 세균성 전염병 환자들의 목숨을 구함. 1945년 페니실린의 개발자인 Fleming 은 노벨 생리 의학상을 수 상.

31 Plasmid DNA란? Bacteria의 세포 내에 chromosome DNA와는 별개 로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA. Bacteria 의 생존에 Plasmid DNA 의 존재가 필수적인 것이 아니며, 다른 종의 세 포 내에 전달됨. Plasmid DNA에는 항생제 저 항성을 가진 내성인자임. 세균의 자웅을 결정하는 성 결정인자 등이 존재함.

32 Plasmid DNA 응용 Plasmid DNA를 응용한 vector로써 pBR계, pUS 계를 많이 사용.
항생제 저항성 및 복제 부위를 이용하여 형질 전환 및 형질도입 등에 이용.