DNA 추출 & PCR(Polymerase Chain Reaction

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1 DNA 추출 & PCR(Polymerase Chain Reaction
일반생물학실험II DNA 추출 & PCR(Polymerase Chain Reaction

2 유전자 분석의 원리-PCR 기반 유전자란? 생물(生物)은 모두 유전자를 가지고 있으며, 세포의 구성 및 세포간의 유기적 관계를 이루는데 필요한 모든 정보가 담겨 있으며 생식을 통해 자손에게 유전된다. 물질상태로는 DNA의 A, G, C, T로 이루어진 염기서열을 의미하며, 정확히는 DNA 서열 가운데 정보를 갖는 부분(exon)을 뜻한다.1) 그림출처: 위키백과/유전자 그림출처: Hello DL.com( ) 유전자 검사는 일부 종양의 진단 및 돌연변이, 염색체이상 등을 진단할 뿐 아니라 사람과 사람 및 종간의 구분에도 사용되며 검사방법으로는 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 순차배열분석(DNA sequencing), 혹은 염색체 검사(karyotyping), 형광동소보합법 등이 있다.2) 참고문헌 위키백과/유전자 서울대학교병원 의학정보/유전자검사

3 유전자 분석의 원리-PCR 기반 PCR(Polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)
사람의 genome과 같이 매우 복잡하며 양이 지극히 미량의 DNA에서 연구자가 원하는 생물이나 사람의 특별하고 고유한 DNA 부분만을 선택적으로 증폭 시켜 확인 할 수 있다. 실험과정이 간단하고, 전자동 기계를 이용하기 때문에 분자생물학, 의료, 범죄수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다.1) PCR 원리 동영상 – 출처 유투브 그림출처: openwerware.org 참고문헌 위키백과/중합효소 연쇄반응

4 실험방법 PCR 기반 유전자 분석의 단계 시료 채취 예) 모근, 혈액, 구강상피세포 DNA 추출 PCR 참고문헌

5 시료 채취 or 구강상피세포 : 멸균되었거나 깨끗한 면봉 이용 혈액 : 멸균되었거나 깨끗한 면봉 이용
STE buffer 300㎖(Proteinase K 7.5 ㎖) + sample 혈액 : 멸균되었거나 깨끗한 면봉 이용 머리카락 : 모근이 꼭 있어야 함 참고문헌

6 DNA Extraction Step 1. Phenol 50℃ 기존의 tube에 phenol 1volume을 넣는다. 원심분리
300㎕ (sample + STE) 기존의 tube에 phenol 1volume을 넣는다. 원심분리 15,000rpm/3min/RT 50℃ 50℃ 항온수조 2~3h sample vortex 참고 및 주의사항 1 volume: 기준은 sample이 들어 있는 buffer의 부피로 하며, 기준이 된 sample의 부피와 동일한 부피를 말한다. RT(room temperature): 25℃ Phenol: 유기용매, 피부에 닿게 되면 화상의 위험성으로 주의 요망

7 DNA Extraction Step 2. Phenol : Chloroform 원심분리 15,000rpm/3min/RT
상층액 vortex 300㎕ (phenol:chloroformsample =1:1=150 ㎕ :150 ㎕) Phenol:Chloroform=1:1로 1voume이 든 새 tube에 원심분리가 끝난 tube의 상층액을 옮겨 담는다. 참고 및 주의사항 Chloroform은 유기용매이므로 피부에 닿지 않도록 주의

8 DNA Extraction Step 3. Chloroform 원심분리 15,000rpm/3min/RT
상층액 vortex 300㎕ chloroform Chloroform 1voume이 든 새 tube에 원심분리가 끝난 tube의 상층액을 옮겨 담는다.

9 DNA Extraction Step 4. Ethanol down -70℃(30min) 0r -20℃(overnight)
200㎕ 상층액 -70℃(30min) 0r -20℃(overnight) inverting 400㎕ 100% Ethanol 20㎕ 3M NaOAC 상층액을 200㎕만 새로운 tube에 옮긴 후, 상층액을 기준으로 100% Ethanol 2volume과 3M NaOAC 1/20 volume을 넣고 inverting한다. 피펫의 팁이 상층액의 중심에 닿도록 해야함, 벽면에 팁이 닿게 되면 Chloroform이 딸려오게 됨 참고 및 주의사항 Chloroform이 딸려오면 DNA 침전에 방해가 될 수 있으므로 상층액만 조심스럽게 따낼 것 Overnight=16hours

10 DNA Extraction 70% ethanol을 넣어 주어 남아있는 염을 제거한다.
원심분리 15,000rpm/10min/4℃ 침전물을 제외한 모든 수용액 버린다. 흰색 침전물=DNA 70% ehtanol 200~400㎕ 넣는다. 70% ethanol을 넣어 주어 남아있는 염을 제거한다. 흰색 침전물을 제외한 모든 수용액을 버린다. 참고 및 주의사항 1) 흰색의 침전물은 DNA며 수용액을 버릴 때 같이 버려지지 않도록 조심해야 한다.

11 DNA Extraction Step 4. 70% Ethanol wash 원심분리 15,000rpm/5min/4℃
침전물을 제외한 모든 수용액 버린다. 흰색 침전물=DNA 증류수 20~50㎕ 흰색 침전물을 제외한 모든 수용액을 버린다. 증류수 20~50㎕ 넣고 침전된 DNA를 녹인다. 참고 및 주의사항 침전된 DNA가 버려지지 않도록 조심할 것

12 PCR Step . PCR ① ② ④ ⑤ ③ ⑥ ① pre-Denaturation: DNA 이중나선 풀림
94℃ 65℃ 72℃ 4℃ 2min 1min 5min ∞ 30cycle ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 단위: ㎕ MIXture 요소 부피 D.W(증류수) 14.44 10X buffer 2 DNA 1 Primer F 0.4 Primer R 2.5mM dNTP 1.6 Taq polymerase 0.16 최종 부피 20 ① pre-Denaturation: DNA 이중나선 풀림 ② Denaturation: DNA 이중나선 풀림 ③ Annealing: primer가 DNA에 상보적으로 붙음 ④ Elongation: DNA 단편의 복제 ⑤ post-Elongation ⑥ End 참고 및 주의사항 Primer는 증폭되는 단편의 길이의 양쪽 끝에 붙는다.(유투브 동영상 참고) dNTP는 doxy nucleic tri-phospate의 약자이며 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함한다.-DNA의 재료 Taq polymerase는 고온에서도 활동을 할 수 있는 효소이다. 이 효소가 DNA의 복제를 가능하게 한다. 숫자 뒤의 X(예 10X, 1X, 2X등)는 농도의 배수를 의미한다. 10X=10배, 1X=1배, 2X=2배

13 전기영동 Step 6. 1.6% Agarose gel 만들기 1X TAE buffer와 아가로스 파우더를 섞는다.
1X TAE buffer 40ml + agarose 0.64g 전자레인지에서 녹임 1X TAE buffer와 아가로스 파우더를 섞는다. 10~15분 정도 식힌 후 약 50℃ 정도가 되면 EtBr을 1㎕정도 넣고 몰드에 부은 후 약 20분 동안 굳힌다. 참고 및 주의사항 EtBr은 발암물질이므로 제작하는 동안 비닐장갑을 끼고 할것 아가로스는 높은 온도에서 녹으므로 전자레인지를 이용하여 녹이는데, 온도가 높아지면 끓으면서 폭발하게 됨으로 계속 관찰하면서 만들 것 50℃는 손바닥 위에 올려 놓으면 약간 뜨겁다고 느낄 정도이며, 손에 올려놓을 수 있는 온도이다.

14 전기영동-유전자 분석 Step 6. DNA loading & 분석
전기영동은 DNA의 –극의 성질을 이용한 것으로 전기를 걸어주면 +극 쪽으로 이동을 하게 된다. DNA는 아가로스 젤이라는 곳에 넣게 되는데 이 젤은 그물 구조로 되어 있어 DNA의 진행속도가 길이에 따라서 달라지게 되어 DNA의 길이를 알 수 있게 되는 방식이다. PCR을 통해 증폭된 여러 개나 하나의 DNA 단편을 전기영동하여 똑같은 유전자인지 아닌지를 구분할 수 있다. 참고 및 주의사항 EtBr은 발암물질이므로 제작하는 동안 비닐장갑을 끼고 할것

15 전기영동-유전자 분석(예시) 자녀 4명중 딸 1은 엄마와 아빠의 친딸. 딸2는 아빠가 다른 엄마의 딸.
아들1은 친부모가 맞음. 아들2는 다른 집 자녀.