Chapter 12. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (핵 자기 공명 분광학) 중앙조절장치 RISC-based control system 3 RF Generator/Amplifier RF pluse Analogue data Acquisition Console Hosting and controlling Data processing 초전도자석 고성능 컴퓨터 Ultra-shielded 11.7T Magnet 4 channel probehead XYZ triple-axis gradient coil

핵자기공명 분광기 Varian의 900MHz NMR 미국 Scripps 연구소에 세계최초로 설치된 900MHz NMR Varian의 900MHz NMR 위의 사진은 여러 종류의 NMR spectrometer입니다. 제일 덩치가 큰 것이 가장 강력한 초전도 자석이 들어있습니다.

핵자기 공명 기술과 노벨상 핵자기 공명 기술은 분광학의 수준을 한 단계 끌어 올린 기술로 1952년과 1991년, 2002년에 노벨 물리학상(1952년)과 노벨 화학상(1991년, 2002년) 수상의 영예를 안았다. 핵자기 공명을 검출하는 새로운 기술을 발명한 펠릭스 블락(Felix Bloch ,스위스)과 에드워드 밀스 퍼셀(E.M.Purcell, 미국) -1952년 노벨 물리학상 수상 펠릭스 블락 E.M 퍼셀 a b c 세계 최초의 핵자기 공명 검출 장치 세계 최초의 핵자기 공명장치를 이용한 에틸 알코올의 수소 스펙트럼 ( a: CH3 b: CH2 c: OH )

2. 핵자기 공명 분광학의 신기원을 이룩한 리차드 R. 에른스트 (Richard R 2.핵자기 공명 분광학의 신기원을 이룩한 리차드 R. 에른스트 (Richard R. Ernst, 스위스)-1991년 노벨 화학상 수상 에른스트는 최초로 퓨리에 변환을 핵자기 공명 기술에 접목하여 시간에 따른 핵 스핀의 변화를 관찰하는 기술을 개발하였다. 이 기술은 현대 핵자기 공명 장치의 모태가 되었다. 리차드 R. 어른스트 종이 테이프와 천공 카드를 이용한 컴퓨터를 이용해 최초의 FT-NMR 실험을 하고 있는 에른스트 에른스트에 의해 핵자기 공명 분광학에 도입된 퓨리에 변환

NMR Spectroscopy를 이용한 단백질 구조 결정 방법을 만들어 생물학의 세계를 넓힌 Kurt Wüthrich (ETH & Scripps) -2002년 노벨 화학상 수상 Kurt Wuthrich 교수는 핵자기 공명 분광학을 이용하여 생체분자에 가장 많이 존재하는 수소간의 공간적 위치를 알아냄으로써 생체 분자의 3차원 구조를 모델링하는 방법을 개발했다. 기존의 X-선 방법에 비해 생체조건과 비슷한 용액(버퍼)상태의 3차원 구조를 규명함으로 생체를 분자적 수준에서 이해 할 수 있는 장을 마련했다. 핵자기 공명 분광학을 이용한 생체분자 구조 결정 방법은 떨어진 점들을 연결하여 집을 그리는 것과 같다. 핵자기 공명 분광학을 통해 밝힌 광우병 유발 단백질, 프라이온(prion)의 삼차원 구조

The Central Dogma of Molecular Biology DNA RNA PROTEIN

Structure dictates its function B. Signalling via metal binding:lactoferrin DNA replication component

Structure Determination Isolate DNA sequence ..ATGTACATTAGCCTATAGGCCC.. Clone into Overexpression vector Express Protein Structure Determination X-ray crystallography NMR spectroscopy

Structure determination by NMR

NMR 거리 정보를 이용한 단백질의 구조 결정 3 1 2 4 5 단백질 Distance Geometry 1. 아직 그 구조를 모르는 단백질입니다. 구조결정에 중요한 부분이 표시되어 있습니다 2. NMR실험을 통하여 서로 상호 작용하는 원자들을 구분해 냅니다. 3. Spectrum을 분석해서 서로 근접한 원자를 찾아내고 그 거리를 구합니다 4. 구한 거리로 단백질 위의 원자들을 짝 지웁니다 5. 위의 정보를 가지고 컴퓨터로 구조를 계산합니다 6. 완성된 구조입니다. 단백질 2 N’ C’ A B C D E F G H 1 F G A B C E D H 3 5 Distance Geometry A B C D E F G H 4

Chemical shifts for different nuclei For protons, ~ 15 ppm: For carbon, ~ 220 ppm: TMS ppm 2 10 7 5 15 Aliphatic Alcohols, protons a to ketones Olefins Aromatics Amides Acids Aldehydes 50 150 100 80 210 Aliphatic CH3, CH2, CH Carbons adjacent to alcohols, ketones Aromatics, conjugated alkenes C=O of Acids, aldehydes, esters C=O in ketones

One-dimensional (1D) NMR spectrum of a protein Ha

1차원 NMR 3차원 NMR 2차원 NMR

2D NMR : COSY Cross peaks contain new information as a result of magnetization transfer during the 2D experiment In a COSY spectrum the scalar J-coupling yields transfer of magnetization from the NH to the Ha and vice versa which belong to the same scalar couplied spin system The cross peak therefore provides information about intraresidue 1H, 1H correlations

The COSY Spectrum of Protein

The nuclear Overhauser effect (NOE) 2D-NOESY R NOE 1/R 6

NOE assignment

Scalar/J-coupling Karplus curve J-couplings across 3 bonds depend on the intervening central torsion angle – the 3-bond HN, Ha coupling 3J(HN, Ha) in proteins is a measure of the backbone torsion angle f

Characteristic NOE patterns Interesidue and sequential NOE - NOEs among protons of the same residue and from a residue to protons of the (i + 1) and (i - 1) residues: Apart from those, regular secondary structure will have regular NOE patterns N O A 3 2 H 1 Ha daN dNN daa dab, dag, … dNb, dNg, …

Inter-atomic distances in secondary structures alpha-helix parallel beta-sheet antiparallel beta-sheet type I turn type II turn

Summary of nOe’s vs secondary structures residue # d~2.8 Å d~2.2 Å A thick bar means a strong NOE (short distance), a thin bar means a weak NOE (long but still visible distance)

Coupling constants and dihedral angles Torsions around rotatable bonds in amino acids residues - the 3J coupling constants present in the peptide spin system (also true for sugars, DNA, RNA) 3JNa - the conformation of the peptide backbone 3Jab - the side chain conformation N O H Ha Hb AA f c y w 3JNa f 3Jab c The 3J coupling constants are related to the dihedral angles by the Karplus equation

Calculated Structures from NMR Data

[H, 15N] correlation spectra: Finger-print region for protein

Theoretical Aspects of NMR dj/dt=μxB0 Random directed spin polarization Spin precession

NMR Spectroscopy: Basic Principle

Chemical shift ω = γB B = Bo (1-σ) δ = (ω - ωREF) x106 / ωREF Deshielding effect in benzen molecule

The Chemical Shift Resonance frequencies are field dependent Define a field-independent parameter - the chemical shift ()

Concepts of NMR Structure calculation

30kDa Protein/Ligand Complex O H 3D NMR data of FTZ-F1: TROSY-HNCO (600MHz) 30kDa Protein/Ligand Complex O H C N C H R 15N 13CO NH