Western Blot Analysis using His-Tag Antibody 조교 : 최 혜 정 (s338)

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1 Western Blot Analysis using His-Tag Antibody 조교 : 최 혜 정 (s338) hjcielo@naver.com

2 Today.... Chapter6. protein overexpression in E.coli and purification by affinity chromatography Chapter8. SDS PAGE & Bradford assay Chapter9. Western blot analysis using His-Taq antibody

3 Today.... PAGE gel Transfer to membrane Blocking Primary Ab binding & Secondary Ab binding Detection

4 Sample(His fusion protein) IPTG induction > protein overexpression in E.coli Input, FT, wash, binding sample 10% SDS - PAGE gel loading

5 1. Southern blotting DNA molecules 을 agarose gel 로부터 membrane 으로 옮긴 후, 특정적인 DNA sequence 를 probe 로 사용하여 detection 해내는 방법 2. Northern blotting Northern blot 은 Southern blot 과 같은 원리이며, DNA 대신 특정한 RNA 를 detection 하는 방법이다. Blotting ?

6 3. Western blotting - Antigen-Antibody reaction 을 이용하여 여러 proteins 혼합물 중에서 원하는 특정 단백질만을 찾아내는 방법. -Immunoblotting 라고도 함. - 원하는 protein 에 대한 high-quality antibody 가 필요. Blotting ?

7 -western blotting -immunohistochemistry -ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) -immunoperoxidase cell staining -immunofluorescnce cell staining -immunoprecipitation -flow cytometry Experiments Using Antibody

8 1. Advantages of Western blotting - - To test antigenicity of specific proteins - To identify specific proteins - To identify their molecular weights - - 소량의 protein 도 detection 이 가능 2. The basic blotting procedure - Preparation of the antigen sample - Resolution of the sample by gel electrophoresis - Transfer of the separated polypeptides to a membrane support - Blocking nonspecific binding sites on the membrane - Addition of the antibody(primary Ab & secondary Ab) - Detection Principles of Western blotting

9 SDS-PAGE

10 Transfer - polyacrylamide gel 에서 protein sample 을 분리한 후, proteins 를 ( gel 에서 분리된 양상대로 ) membrane 에 옮기는 과정 * Membrane 을 사용하는 이유 ? 1) concentration of protein 2) antibody 를 이용한 detection 이 수월하다. 3) gel 보다 다루기가 손쉽다. 4) staining 및 destaining 이 빠르다. 5) 장기간의 보관이 용이하다. * Transfer buffer 1) 20% methanol : membrane 에 존재하는 protein 의 binding capacity 증가 2) 0.1% SDS – low conc. of SDS in buffer can improve transfer efficiency.

11 Principles of Western blotting Membranes 특징 Nitrocellulose (NC) membrane excellent sensitivity excellent resolution low background Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane* high protein binding capacity physical strength and chemical stability Nylon membraneunacceptably high background Transfer membrane 의 종류 및 특징

12 (A) Tank transfer (B) Semidry transfer (A) Tank transfer (B) Semidry transfer Confirmation of transfer Confirmation of transfer 1. Prestained markers 2. Blot staining- Ponceau S 3. Gel staining- Coomassie™ blue Principles of Western blotting

13 Blocking Blocking - membrane 상에서 antibody 와 protein 의 non-specific binding 을 피하기 위함. Washing - Western blotting 은 여러 가지 연속적인 binding steps 을 거침. - non-specific binding 을 최소화 해주는 과정. Common membrane blocking reagents ReagentFormulationComments Dried milk5% non-fat dried milk in PBS or TBSMasks some antigens Milk/Tween-205% non-fat dried milk in PBS or TBS, 0.1% Tween 20Masks some antigens Tween-200. 1% Tween 20, 0.02% NaN 3 in PBS or TBSCan stain after detection BSA0.3–3% bovine serum albumin, 0.02% NaN 3 in PBSLower endogenous cross-reactivity Principles of Western blotting

14 Addition of Primary antibody - primary antibody 는 membrane 에 붙어있는 target antigen protein 을 인식 - antigen 특정 부위에 binding 함 # appropriate dilution 이 중요 - Mixture 에서 우리가 원하는 protein 을 high specificity 로 detection - non-specific background 는 최소화 하는 범위 Principles of Western blotting

15 Addition of Secondary antibody - 가장 일반적으로 primary antibody 을 detection 할 수 있는 system - original primary antibody 에 대한 species specific 하게 준비 Ex> goat anti-rabbit secondary Antibody for detection of a rabbit primary Antibody - 가장 일반적으로 horseradish peroxidase (HRP) 혹은 alkaline phosphatase (AP) 와 같은 reporter enzyme 을 가지고 있다 # 적당한 enzyme substrate 을 반응 ECL western blotting BCIP/NBT Western blotting Principles of Western blotting

16 Detection method Detection method SystemSubstrate 1 Product Chromogenic HRPDABbrown precipitate, addition of Ni or Co ions increases sensitivity TMBblue precipitate 4CNblue/black precipitate APBCIP/NBTblack/purple precipitate Chemiluminescent (ECL, ECL Plus) HRPLuminollight, glow or flash AP Dioxetane- phosphate light, glow 1 Abbreviations:....DAB: 3,3'-diaminobenzidine....4CN: 4-chloro-1-naphtol....BCIP: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate....NBT: nitroblue tetrazolium....TMB: 3,3'5,5' tetramethylbenzidine Principles of Western blotting Commonly used chromogenic and chemiluminescent detection systems

17 Materials 1. Electrophoresis - SDS-PAGE gel (10%) - 1X Tris-glycerine electrophoresis buffer (25 mM Tris-base, 250 mM glycine, 0.1% (w/v) SDS) 2. Transfer - Transfer buffer (48 mM Tris-base, 39 mM glycine, 20% Methanol) - Nitrocellulose membrane 3. Blocking - Blocking buffer (5% (w/v) non-fat dried milk, 0.05% (w/v) sodium azide in TBST) 4. Binding of 1 st Antibody - Primary antibody in 1% non-fat dried milk (1:500 dilution) 5. Binding of 2 nd Antibody - Secondary antibody in 1% non-fat dried milk (1:2000 dilution) 6. Washing - TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.1% Tween 20)

18 1. SDS-polyacrylamide gel 만들기 1. SDS-polyacrylamide gel 만들기 2. Sample 준비 2. Sample 준비 3. Gel electrophoresis 3. Gel electrophoresis -Gel caster 에서 gel 을 떼어낸 다음 tank 에 장착하고 tank buffer 를 채운다. -Sample 을 loading 한 후 dye 가 바닥에 올 때까지 running 한다. 4. Transfer 4. Transfer -membrane, Wattman paper(4 장 준비 ) 를 sponge 크기에 맞게 미리 자른 후 transfer buffer 에 담가둔다. -Transfer sandwich 만들기  (white) sponge/paper/membrane/gel/paper/sponge (black) -transfer tank 에 장착하고 transfer 한다. (90V, 300 mA, 40 mins) Gel/Membrane Sandwich Methods

19 5. Blocking (30 min/ RT) 5% non-fat milk in TBST 5ml 에 membrane 을 담가두고 rocker 에 둔다. 6. 1st Ab binding/TBST (30 min/RT) washing solution 을 버리고 1% non-fat milk in TBST 5ml 에 mouse anti-His Ab 10ul (1:500) 를 부운 후에 rocker 에 30 분 간 둔다. 7. Washing primary Ab 를 버리고 Rocker 위에서 TBST 로 5 분간 3 번 씻어준다. 8. 2nd Ab binding/TBST (20 min/RT) washing solution 을 버리고 1% non-fat milk in TBST 5ml 에 goat anti-mouse IgG-AP conjugated Ab 2.5ul (1;2000) 를 부은 후에 rocker 에 20 분간 둔다. 9. Washing secondary Ab 를 버리고 Rocker 위에서 TBST 로 5 분간 3 번 씻어준다. 10. AP staining NBT/BCIP solution 10ml 을 바로 membrane 에 붓고 band 가 나타날 때까지 rocking 해준다. 12. 확인 발색되는 band 를 확인한 후에는 5ml TBST 로 씻어준다. Methods

20 250 148 98 64 50 36 22 16 BCIP/MBT Western blotting MI FT W P ECL Western blotting I FT W P 200 116 97.4 66 45 31 21.5 CBB MI FT W P M; marker I; input (crude extract) FT; flow through W; washing P; purified Result

21 Markers

22 Result CBB staining 70kDa 100kDa 130kDa 50kDa ??? WB using His Ab

23 Discussion & Further Study 1.Antibody 를 이용한 실험 – 원리 및 이용법 정리 2. Monoclonal Ab vs. Polyclonal Ab 차이점 정리 실험 목적, discussion, further study  handwritting!! 11/23( 월 ) pm6:00 s338 제출하세요 !!