아미노산의 분리 및 정 성분석 조교 : 최원영 Genome Regulation Center 첨단관 201B( 내선 7699), 010-5582-6638.

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1 아미노산의 분리 및 정 성분석 조교 : 최원영 Genome Regulation Center cyberon21@hanmail.net 첨단관 201B( 내선 7699), 010-5582-6638

2 1. 닌히드린 반응 (Ninhydrin reaction) 2. 종이 크로마토그래피 (Paper chromatography) 3. 종이 전기영동법 (Paper chromatography) 실험 목차

3 실 험 원 리실 험 원 리

4 1. 닌히드린 반응 (Ninhydrin reaction) 닌히드린을 아미노산의 중성용액에 가하면 아미노기의 작용에 의해서 닌히드린 2 분자가 축합하여 아미노산의 종류에 따른 특유한 색을 나타낸다. Ex) histidine : 청자색, proline : 노란색 ( 황색 ) 닌히드린을 아미노산의 중성용액에 가하면 아미노기의 작용에 의해서 닌히드린 2 분자가 축합하여 아미노산의 종류에 따른 특유한 색을 나타낸다. Ex) histidine : 청자색, proline : 노란색 ( 황색 )

5 1. 닌히드린 반응 (Ninhydrin reaction) Proline 과 hydroxy-proline 을 제외하고, 단백질에서 발견되는 alpha-amino acids 는 닌히드린과 반응하여 비슷한 세기의 보라색 빛을 발한다. Proline 과 hydroxy-proline 을 제외하고, 단백질에서 발견되는 alpha-amino acids 는 닌히드린과 반응하여 비슷한 세기의 보라색 빛을 발한다. Proline Hydroxyprol ine

6 1. 닌히드린 반응 (Ninhydrin reaction) 이 발색은 예민하여 50~100 만분의 1 정도의 감도 ( 感度 ) 를 나타내므로, 아미노산 및 단백질의 확인에 보편적으로 쓰일 뿐 아니라 아미노산의 정량에도 사용된다. 이 발색은 예민하여 50~100 만분의 1 정도의 감도 ( 感度 ) 를 나타내므로, 아미노산 및 단백질의 확인에 보편적으로 쓰일 뿐 아니라 아미노산의 정량에도 사용된다.

7 2. 종이 크로마토그래피 (Paper Chromatography) 혼합물을 분리하거나 분석하는 실험. 혼합물을 분리하거나 분석하는 실험. 종이 크로마토그래피의 종류 종이 크로마토그래피의 종류 -Descending Paper Chromatography -Ascending Paper Chromatography -Ascending-Descending Paper Chromatography -Horizontal Paper Chromatography -Two-Dimensional Paper Chromatography

8 시료의 성분도 용매와 함께 이동하지 만 각 성분은 물과 유기 용매에 대한 용 해도의 차이 때문에 이동 속도가 각각 다르게 된다. 즉, 유기 용매에 잘 녹는 성분은 덜 녹는 성분보다 먼 곳까지 이 동하게 되므로 거름종이 위에서 성분들 이 분리된다. 종이 위에 분리된 각 성분의 위치는 이 들이 무색일 경우에는 적당한 발색 시약 ( 닌히드린 ) 을 뿌려서 쉽게 확인할 수 있 다. 또, 각 성분의 이동 거리는 R f 값으로 나타낸다. 2. 종이 크로마토그래피 (Paper Chromatography)

9 Descending ChromatographyHorizontal Chromatography Paper chromatography Biology Experiment http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=TJELxCk0jy8`

10 종이 크로마토그래피에 있어서 … 종이 크로마토그래피에 있어서 … 불활성 상 (Inert phase) : 거름 종이 ( 정지상의 지지 체로 작용 ) 불활성 상 (Inert phase) : 거름 종이 ( 정지상의 지지 체로 작용 ) 정지 상 (Stationary phase) : 물 ( 종이에 흡착되어 종이의 내부 공간을 채우게 됨 ) 정지 상 (Stationary phase) : 물 ( 종이에 흡착되어 종이의 내부 공간을 채우게 됨 ) 이동 상 (Mobile phase) : 유기 용매 ( 물과 잘 섞이지 않음 ) 이동 상 (Mobile phase) : 유기 용매 ( 물과 잘 섞이지 않음 ) 2. 종이 크로마토그래피 (Paper Chromatography)

11 3. 종이 전기이동법 (Paper Electrophoresis) Electrophoresis ( 전기 이동 ) Electrophoresis ( 전기 이동 ) 하전된 입자가 전기장에서 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상 하전된 입자가 전기장에서 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH 와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 전하량, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정되므로 아미노산, 단백질, 핵산과 같은 하전된 물질들을 분리하는데 매우 효과적인 수단으로 이용된다. 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH 와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 전하량, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정되므로 아미노산, 단백질, 핵산과 같은 하전된 물질들을 분리하는데 매우 효과적인 수단으로 이용된다.

12 3. 종이 전기이동법 (Paper Electrophoresis) Paper Electrophoresis ( 종이 전기 이동 ) Paper Electrophoresis ( 종이 전기 이동 ) Acidic amino acids : Aspartic acid (pI 2.77), Glutamic acid (pI 3.22) Basic amino acids : Lysine (pI 9.74), Arginine (pI 10.76), Histidine (pI 7.59)

13 3. 종이 전기이동법 (Paper Electrophoresis) Experimental example Experimental example

14 전기 이동도 (Electrophoretic mobility, μ ) 전기 이동도 (Electrophoretic mobility, μ ) 전기장의 세기가 1 volt/cm 일 때의 어떤 입자의 이동속도 전기장의 세기가 1 volt/cm 일 때의 어떤 입자의 이동속도 μ = v/E = q/f = qD/kT v = 입자의 속도 (cm/sec)E = 전기장의 세기 (volt/cm) q = 입자의 알짜전하 D = 입자의 확산계수 k = Boltzmann 상수 T = 절대온도 f = 입자의 마찰저항계수 ( 입자의 크기와 모양의 함수 ) 종이 전기 이동법 종이 전기 이동법 적은 양의 시료용액을 거름 종이 ( 지지체 ) 에 실은 후 전류를 통하여 시료의 성분들이 이동하게 하는 법. 적은 양의 시료용액을 거름 종이 ( 지지체 ) 에 실은 후 전류를 통하여 시료의 성분들이 이동하게 하는 법. 시료의 성분들의 분리 형태는 닌히드린 발색 반응을 이용하여 육안으로 관측. 시료의 성분들의 분리 형태는 닌히드린 발색 반응을 이용하여 육안으로 관측. 3. 종이 전기이동법 (Paper Electrophoresis)

15 실 험 방 법실 험 방 법

16 시약 및 기자재 시약 및 기자재 E-tube, 1% amino acid solution(Alanine, Glycine, Proline, Methionine, Leucine), 0.3% Ninhydrin (0.6 g/ 200ml n-butanol), pipettman (20p, 1000p), heat block, mini potE-tube, 1% amino acid solution(Alanine, Glycine, Proline, Methionine, Leucine), 0.3% Ninhydrin (0.6 g/ 200ml n-butanol), pipettman (20p, 1000p), heat block, mini pot 실험 방법 실험 방법 준비된 E-tube 에 1% amino acid solution 1 ml 을 넣는다. 준비된 E-tube 에 1% amino acid solution 1 ml 을 넣는다. 준비된 시료 ( 총 5 개 ) 에 0.3% Ninhydrin 을 50 ul 가한다. 준비된 시료 ( 총 5 개 ) 에 0.3% Ninhydrin 을 50 ul 가한다. 잘 섞어준 다음 100 ℃ 에서 2 min 정도 끓인 후 색 변화를 관찰한다 잘 섞어준 다음 100 ℃ 에서 2 min 정도 끓인 후 색 변화를 관찰한다 닌히드린 발색실험 1. 닌히드린 반응 (Ninhydrin reaction)

17 시약 및 기자재 시약 및 기자재 E-tube, 1% Glycine, 0.3% Ninhydrin (0.6 g/ 200ml n-butanol), pipettman (20p, 200p, 1000p), heat block, mini potE-tube, 1% Glycine, 0.3% Ninhydrin (0.6 g/ 200ml n-butanol), pipettman (20p, 200p, 1000p), heat block, mini pot 실험 방법 실험 방법 준비된 E-tube 에 1% glycine 1 ml 을 넣는다. 준비된 E-tube 에 1% glycine 1 ml 을 넣는다. Glycine 을 1/4 씩 dilution 하면서,Glycine 을 1/4 씩 dilution 하면서, 1 % → 0.25 % → 0.0625 % → 0.0156 % ……. 1 % → 0.25 % → 0.0625 % → 0.0156 % ……. Glycine 시료 (750 ul) 를 준비한다. 준비된 시료 ( 총 6 개 ) 에 0.3% Ninhydrin 을 50 ul 가한다. 준비된 시료 ( 총 6 개 ) 에 0.3% Ninhydrin 을 50 ul 가한다. 잘 섞어준 다음 100 ℃ 에서 3 min 정도 끓인 후 색 변화를 관찰한다 잘 섞어준 다음 100 ℃ 에서 3 min 정도 끓인 후 색 변화를 관찰한다 한계농도 측정실험 1. 닌히드린 반응 (Ninhydrin reaction)

18 한계농도 측정실험 Dilution method Dilution method 1% glycine 1 ml 250ul 0.25% glycin e 0.0625% gly cine 0.0156% gly cine TDW 750ul

19 시약 및 기자재 시약 및 기자재 1% 아미노산 용액 (Alanine, Lysine, Proline, Glycine, Leucine, 미지용액 X), 0.3% Ninhydrin, 전개수용액 ( 부탄올 : 아세트산 : 증류수 =4:1:5), 전개용지 (Whatman paper), pipettman (20p), yellow tip, 크로마토그래피 용기, 드라이기, hood, spray, drying oven (90 ℃ )1% 아미노산 용액 (Alanine, Lysine, Proline, Glycine, Leucine, 미지용액 X), 0.3% Ninhydrin, 전개수용액 ( 부탄올 : 아세트산 : 증류수 =4:1:5), 전개용지 (Whatman paper), pipettman (20p), yellow tip, 크로마토그래피 용기, 드라이기, hood, spray, drying oven (90 ℃ ) 실험 방법 – 전개 수용액을 크로마토그래피 용기의 바닥에 적당히 채운다. – 연필로 종이의 끝에서 2cm 떨어진 곳에 선을 긋고, 2cm 간격으로 선 위에 x 표시를 한다. 아미노산 Alanine, Lysine, Proline, Glycine, Leucine 각 1% 수용 액과 각 조에 주어진 미지 아미노산 혼합물 X 를 2 ul 씩 채취하여 표시된 x 에 지름 3mm 미만이 되도록 점적 하여 말린다. 5 회 반복. 2 2. 종이 크로마토그래피 (Paper Chromatography)

20 용기에 시료가 위치한 쪽을 바닥 쪽으로 하여 1cm 정도가 잠기도록 크로마토그래피 용지를 담근다. 이 때 용지가 용기 벽에 닿지 않도록 주의한다. 용기에 시료가 위치한 쪽을 바닥 쪽으로 하여 1cm 정도가 잠기도록 크로마토그래피 용지를 담근다. 이 때 용지가 용기 벽에 닿지 않도록 주의한다. 용기를 밀봉한 후 2 시간 방치한다. 용기를 밀봉한 후 2 시간 방치한다. 용지를 꺼내어 전개액이 전개된 끝을 연필로 표시한다. 용지를 꺼내어 전개액이 전개된 끝을 연필로 표시한다. Hood 에서 닌히드린 수용액을 뿌린 후, 100 ℃ drying oven 에서 말린다. Hood 에서 닌히드린 수용액을 뿌린 후, 100 ℃ drying oven 에서 말린다. 각각의 시료에 대하여 전개액이 전개된 비율과 아미노산이 전개된 비율을 구하여 R f 값을 구한다. 각각의 시료에 대하여 전개액이 전개된 비율과 아미노산이 전개된 비율을 구하여 R f 값을 구한다. 미지의 시료가 무엇인지 밝힌다. 미지의 시료가 무엇인지 밝힌다. 2. 종이 크로마토그래피 (Paper Chromatography)

21 시약 및 기자재 시약 및 기자재 0.1% 아미노산 용액 (Alanine, Lysine) in Tris-acetate (0.007M, pH6.7), Tris-acetate buffer (0.007M, pH7.6), 0.3% Ninhydrin, 전개용지, 연필, 눈금자, pipettman (20p, 1000p), power supply, 드라이기, hood, spray, drying oven (90 ℃ ) 0.1% 아미노산 용액 (Alanine, Lysine) in Tris-acetate (0.007M, pH6.7), Tris-acetate buffer (0.007M, pH7.6), 0.3% Ninhydrin, 전개용지, 연필, 눈금자, pipettman (20p, 1000p), power supply, 드라이기, hood, spray, drying oven (90 ℃ ) 실험 방법 실험 방법 두 전극 칸에 완충용액을 같은 높이로 채운다. 두 전극 칸에 완충용액을 같은 높이로 채운다. 전기이동 방향에 수직으로 종이조각의 중앙에 연필로 출발선을 표시한다. 표시선은 종이 가장자리까지 가지 않도록 표시한다. 또한 종이의 두 끝에다 양극에 + 를, 음극에는 – 를 표시한다. 전기이동 방향에 수직으로 종이조각의 중앙에 연필로 출발선을 표시한다. 표시선은 종이 가장자리까지 가지 않도록 표시한다. 또한 종이의 두 끝에다 양극에 + 를, 음극에는 – 를 표시한다. 3. 종이 전기이동법 (Paper Electrophoresis)

22 종이의 출발선에 40ul 의 alanine, lysine 아미노산을 건조시키면서 여러 번 점적한 후 전기이동 장치에 올려 놓는다. 종이의 출발선에 40ul 의 alanine, lysine 아미노산을 건조시키면서 여러 번 점적한 후 전기이동 장치에 올려 놓는다. 피펫을 사용하여 종이를 완충용액으로 적신다. 각 전극 칸에서 시작하여 출발선 쪽으로 적셔간다. 피펫을 사용하여 종이를 완충용액으로 적신다. 각 전극 칸에서 시작하여 출발선 쪽으로 적셔간다. 종이 전체가 충분히 적셔지면 power supply 를 연결하고 전원을 켜, 150V(7.5volt/cm) 로 40 분 동안 전류를 걸어 준다. 종이 전체가 충분히 적셔지면 power supply 를 연결하고 전원을 켜, 150V(7.5volt/cm) 로 40 분 동안 전류를 걸어 준다. 전개가 끝나면 전기를 끄고 종이를 떼어내어 건조시킨다. 전개가 끝나면 전기를 끄고 종이를 떼어내어 건조시킨다. 닌히드린을 뿌린 후, 100 ℃ drying oven 에서 말린다. 닌히드린을 뿌린 후, 100 ℃ drying oven 에서 말린다. 3. 종이 전기이동법 (Paper Electrophoresis) Ala Ly s

23 실 험 결 과실 험 결 과

24 아미노산과 닌히드린 반응에서 나타나는 발색 아미노산과 닌히드린 반응에서 나타나는 발색 닌히드린으로 감지할 수 있는 Glycine 의 한계 농도 닌히드린으로 감지할 수 있는 Glycine 의 한계 농도 농도 (%) 10.250.06250.01560.00390.00097 색 한계 농도 시료 AlaGlyProLeuMet 변색 1. 닌히드린 반응 (Ninhydrin reaction)

25 종이 크로마토그래피에 의한 아미노산 R f 값과 미지시료 추정 종이 크로마토그래피에 의한 아미노산 R f 값과 미지시료 추정 시료 용매 이동 거리 (mm) 시료 이동 거리 (mm) RfRf 미지시료의 아미노산명 Ala Lys Pro Gly Leu 미지시료 X 2. 종이 크로마토그래피 (Paper Chromatography)

26 R f 값 구하는 법R f 값 구하는 법 2. 종이 크로마토그래피 (Paper Chromatography)

27 아미노산 마찰 계수 f*10 9 (g/sec) Alanine4.93 Lysine6.24 시료이동거리 (cm) 이동속도 (cm/s) 전기 이동도입자의 알짜전하 Alanine Lysine 3. 종이 전기이동법 (Paper Electrophoresis)

28 1. 닌히드린에 의해 생긴 반응물이 발색하는 원리를 설명하시오. 2. 두 가지 이상의 아미노산이 연결된 펩타이드의 경우 종이 전기이동이 되는 정도가 하나의 아미노산에 비해 어떻게 다를까 생각해 보시오. 3. 종이 크로마토그래피를 glycine, alanine, leucine 3 개의 아미노산이 연결된 펩타이드의 서열 분석에 이용한다면 어떻게 사용되겠는지 예측해보시오. 4. 각각 다른 아미노산을 위와 같은 방법으로 분리하고자 실험을 수행하였는데 전기 이동도의 차이가 거의 나지 않았다고 할 때 어떤 방법을 첨가하여 두 아미노산을 구분하겠는지 설명하시오. Paper electrophoresis data 가 없는 경우, 결과 값을 쓰지 말고 고찰에 Alanine 과 Lysine 의 pI 값과 buffer 의 condition 을 고려하여 어느 방향으로 이동하였을지 예상하여 논리적으로 쓰시오. 결과가 나오지 않은 이유도 간단하게 작성하세요. Paper electrophoresis data 가 없는 경우, 결과 값을 쓰지 말고 고찰에 Alanine 과 Lysine 의 pI 값과 buffer 의 condition 을 고려하여 어느 방향으로 이동하였을지 예상하여 논리적으로 쓰시오. 결과가 나오지 않은 이유도 간단하게 작성하세요. Further study

29 보고서 작성 Introduction – 직접 공부하여 작성 Introduction – 직접 공부하여 작성 Method – 꼭 ! 실험한대로 작성 !! Method – 꼭 ! 실험한대로 작성 !! Result - 실험결과 그대로 !! Result - 실험결과 그대로 !! Further study – 본인이 직접 찾아보고 해결 !! Further study – 본인이 직접 찾아보고 해결 !!