5. 중합효소 연쇄반응 (polymerase Chain Reaction). 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭 1986 년 Kary Mullis.

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1 5. 중합효소 연쇄반응 (polymerase Chain Reaction)

2 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭 1986 년 Kary Mullis 발표 – 노벨생리 의학상 중합효소 연쇄반응 세 단계 1) DNA 의 변성 (denaturation) 90°C ∼ 96°C 로 가열하여 double strand DNA(ds DNA) 를 single strand DNA(ssDNA) 로 분리시킨 다. 높은 온도일수록 ssDNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase 도 온도가 아주 높은 상태에 서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C 로 쓴다. Cycle 의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5 분간 시간을 주어야 한다. 2) Primer 의 결합 (annealing) 50°C ∼ 65°C 에서 진행되며, 염기간에 G 와 C 는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A 와 T 는 두군데 에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다. 3) DNA 의 합성 (polymerization) 70°C ∼ 74°C 에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시 간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase 는 보통 1 분에 2,000 ∼ 4,000 nucleotides 를 합 성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb 마다 1 분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle 이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하 게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle 에는 시간을 충분히 (10 분 ) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다. 위 과정이 계속 반복하여 진행되면서 ( 보통 25 ∼ 35 회 ) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합 효소 연쇄반응의 원리이다. PCR; http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQhttp://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ

3 Denaturation (94 º C) 주형 (template) Annealing (Tm º C)

4 PCR 에 필요한 component Template DNA (1 ng – 1 ug) Primers (0.2-1.0 uM) 한쌍 : 증폭하려는 template DNA 에 붙음 dNTPs (50-200 uM): dATP, dGTP, dTTP, dCTP DNA polymerase ( 열에 안정한 효소, Taq DNA polymerase) Mg++ (0.5-2.5 mM): DNA 를 조작하는 대부분의 효소의 cofactor Buffer (monovalent cation (K+), Tris, etc) Thermocycler ( 알루미늄의 heat block 의 온도를 짧은 시간에 자주 변화시킴 ) 5’ 3’ ATCGGCCTTAGCGTAATCCGCATTGCATTCAGTCACTCAT G Primer A Primer B dATP dGTP dTTP dCTP

5 충실성 (Fidelity) 을 결정하는 요인 DNA polymerase 는 세포내에서는 에러를 고정하는 기능 (proofreading) 을 가지지만 시험관내의 제한된 조건에서는 그 기능이 없어서 DNA 를 합성하는 중 에러가 나올 확률이 높다. (Taq DNA polymerase: 1/2X10 4 ) * 여러가지 방법으로 이를 보정함 에러의 확률이 낮은 효소 이용 (Vent DNA polymerase, Pfu DNA polymerase 등 ) annealing 온도를 최상으로 조정 적은 수의 중합 cycle template DNA 의 증가 최적의 Mg++ 농도 결정 최상의 primer 설정 : PCR 의 성공여부를 결정, - 두 primer 의 GC 함량비율이 비슷하여 Tm 도 비슷해야 - 두 primer 가 complementary 하지 않아서 달라붙지 말아야 - 각각의 primer 가 자체내의 inverted repeat 등에 의해 2 차구조형성을 하지 않아야 - 특히 각 primer 의 3’ 말단은 target 에 정확히 달라붙을 수 있어야 : 5’ 말단은 유동성이 있어서 바꿀 수 있음 각 PCR 시행에서의 대조구 실험 (control) 이 반드시 동시에 행해져야 함 target DNA 가 없는 control 두 primer 중에서 한 primer 만 들어간 control primer 가 들어가지 않은 control

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7 잘 디자인된 프라이머와 잘못 디자인된 프라이머로 수행한 PCR 결과 프라이머 디자인 너무 짧을 경우 ; 비특이적 증폭 산물 발생 너무 길 때 ; 주형 DNA 에 결합하는 속도가 느려 증폭 효율이 낮음

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12 Tm = (4 X [G+C]) + (2 X [A+T]) º C Tm ; melting temperature G/C content; 프라이머에 40-60% 사이로 존재 이상적

13 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 901 951 1001 1051 1101 ATGGCGGACG GTGAAGATAT TCAGCCGCTC GTTTGCGATA ACGGGACTGG AATGGTCAAG GCTGGTTTTG CAGGTGATGA TGCTCCTAGA GCTGTATTCC CAAGTATCGT TGGCCGTCCA CGTCACACGG GAGTGATGGT TGGAATGGGA CAAAAGGATG CATACGTCGG AGACGAGGCA CAGTCGAAAC GTGGTATCTT GACTCTCAAG TATCCAATTG AGCATGGTAT TGTCAACAAC TGGGATGATA TGGAGAAGAT TTGGCATCAC ACTTTCTACA ATGAGCTGCG TGTTGCCCCG GAAGAGCATC CGGTTTTGCT AACCGAAGCG CCGCTTAATC CGAAGGCTAA CCGTGAGAAG ATGACACAGA TCATGTTTGA AACATTCAAC ACTCCTGCTA TGTATGTTGC CATTCAAGCT GTTCTCTCCC TCTATGCTAG TGGCCGTACT ACTGGTATTG TTTTGGACTC TGGAGATGGT GTGAGCCACA CGGTACCAAT CTACGAGGGT TATGCACTTC CACACGCAAT CCTGCGTCTT GATCTTGCAG GTCGTGACCT AACCGACCAC CTCATGAAAA TCCTGACAGA GCGTGGTTAC TCATTCACCA CAACTGCTGA GCGTGAGATT GTCAGAGACA TGAAGGAGAA GCTCTCGTAC ATTGCCTTGG ACTATGAGCA AGAGCTTGAG ACTTCCAAAA CCAGCTCATC TGTGGAGAAG AGCTTCGAGC TGCCAGACGG TCAAGTGATA ACCATCGGGG CAGAGCGTTT CCGGTGTCCT GAAGTTCTGT TCCAGCCATC CATGATCGGA ATGGAAAATC CGGGAATTCA TGAAACTACT TACAACTCAA TCATGAAATG TGATGTGGAT ATCAGGAAGG ATCTTTATGG AAACATTGTG CTTAGTGGTG GCACCACAAT GTTTGGCGGG ATTGGTGATA GGATGAGTAA AGAAATCACC GCGTTGGCGC CGAGCAGTAT GAAGATCAAA GTGGTTGCTC CACCGGAAAG GAAGTACAGT GTTTGGATCG GTGGCTCTAT CTTGGCTTCT CTCAGTACTT TCCAGCAGAT GTGGATTGCG AAAGCCGAGT ATGATGAATC TGGACCGTCG ATCGTCCACA GGAAGTGCTT CTGA F-actin; 5’-ATGGCGACGGTGAAGATAT-3’ R-actin; 5’-TGAGAAGCACTTCCTGTGGACGAT-3’

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15 Combinational screening Mix

16 PCR product 3’ 말단에 A 첨가

17 PCR 산물 클로닝 T-vector

18 TOPO-vector -Fast (5 min) -Non-specific cloning

19 프라이머에 BamHI 제한효소 첨가

20 제한효소를 이용한 클로닝 가능

21 PCR 오류율 ; Taq 교정 (proofreading) 3’ 에서 5’ 의 exonuclease 9kb 당 30 주기에 300bp 당

22 중합효소 연쇄반응이 이용되는 실험 1) Probe 로 사용할 목적으로 cloning 된 이중가닥 DNA 의 증폭 2) 적은 양의 mRNA 로부터 특정 cDNA 의 cloning 3) DNA sequencing 4) 돌연변이 검사 5) 병인성 바이러스 및 박테리아 검출 6) 유전자의 footprinting 7) 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조 (site directed mutagenesis) 중합효소 연쇄반응의 의학적 응용 1) HLA 형의 결정 2) 법의학 : 특정인의 유전자 검출 3) 암유전자의 검출 : ras, myc, fos 등 4) 유전성 질병의 진단 : Progressive muscular dystrophy (Duchenne type) 등 5) 감염성 질병의 진단 : Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등