식품분석Ⅰ - 조단백정량 3.1 원리 - 단백질은 질소 (N) 를 함유한다. 즉, 식품 중의 단백질을 정량할 때에는 식품 중의 질소 양을 측정한 후, 그 값에 질소계수 를 곱하여 단백질 양을 산출한다. 질소계수 : 단백질 중의 질소 함량은 약 16% 질소계수 조단백질 (

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1 식품분석Ⅰ - 조단백정량 3.1 원리 - 단백질은 질소 (N) 를 함유한다. 즉, 식품 중의 단백질을 정량할 때에는 식품 중의 질소 양을 측정한 후, 그 값에 질소계수 를 곱하여 단백질 양을 산출한다. 질소계수 : 단백질 중의 질소 함량은 약 16% 질소계수 조단백질 ( 組蛋白質, crude protein) 식품 중에는 단백질 이외에도 질소를 함유하는 물질이 있다. 암모니아 화합물, Purin 염기, Creatine 등 3. Kjeldahl 법에 의한 조단백질 정량 = 100/16 = 6.25

2 식품분석Ⅰ - 조단백정량 1) 질소정량법 (Kjeldahl 법 ) 의 원리 1) 분해 : 시료 중 질소 (N)+H 2 SO 4 →(NH 4 ) 2 SO 4 +SO 2 ↑+CO 2 ↑+CO↑+H 2 O 2) 증류 : (NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH → 2 NH 3 + Na 2 SO4 + 2 H 2 O 3) 중화 : 2 NH 3 + H 2 SO 4 → (NH 4 ) 2 SO 4 4) 적정 : H 2 SO 4 + 2 NaOH → Na 2 SO 4 + 2 H 2 O

3 식품분석Ⅰ - 조단백정량 2) Kjeldahl 법에 의한 단백질 정량 (1) 시약조제 및 농도계수 측정 0.05 N H 2 SO 4 용액, 0.05 N NaOH 용액 ( 표준용액, 농도계수 측정 ) (2) 분해 Kjeldahl flask + 적당량 시료 ( 질소 양으로 10 ㎎∼ 25 ㎎ 정도 ) + 혼합촉매 (CuSO 4 · 5H 2 O 와 K 2 SO 4 의 혼합물 ) 1 ∼ 2 g + 진한 황산 20 ㎖ 정도 → 혼합 → hood 내에서 처음에는 약한 불꽃으로 가열 → 흑색의 점조상이 되면 온도를 높여 가열 → 황록색의 투명한 액이 된 후, 30 ∼ 40 분간 더 가열 → 방냉 → 증류수 약 200 ㎖를 천천히 가하여 분해액을 희석 ( 일부분만 증류할 경우에는 일정한 부피로 정용 )

4 식품분석Ⅰ - 조단백정량 (3) 증류 및 중화 ( 동시에 발생 ) ● 수기 + 0.05 N H 2 SO 4 용액 25 ㎖ 정도 ( 정확한 양 기록 ) + 혼합지시약 3 ∼ 5 방 울 → 냉각관의 끝이 황산 용액에 잠기도록 ● 증류 플라스크 + 분해 액 전부 또는 일부분 ( 약 10 ㎖, 정확한 양 기록 ) + 중화용 40% NaOH 용액 ● 플라스크 + 증류수 + 황산 몇 방울 ( 물 중의 유리암모니아 제거 ) 과 비등석 → 가열 → 수증기 발생 ● 증류 (30 ∼ 40 분, 200 ㎖ 정도 ) ● 수기에서의 반응 H 2 SO 4 + NH 3 → (NH 4 ) 2 SO 4 ● 증류 후 냉각관의 끝 부분을 증류수로 잘 세척 → 수기 분리 ● Kjeldahl 증류장치를 세척

5 식품분석Ⅰ - 조단백정량 Kjeldahl 분해장치 Kjeldahl 증류장치

6 식품분석Ⅰ - 조단백정량 4) 적정 수기에 남아 있는 0.05 N H 2 SO 4 용액 + 0.05 N NaOH 용액 혼합지시약 : 0.1% methyl red alcohol 용액과 0.1% methylene blue alcohol 용액을 1 : 1 로 혼합 ( 자색 → 회색 ) 이 때 소비된 0.05 N NaOH 용액의 양은 시료 + 시약 + 황산지 + 증류수 등의 NH 3 와 반응한 후 수기에 남아 있는 0.05 N H 2 SO 4 용액의 양 (A). 5) 공시험 (blank test) 시료 이외에 실험을 위하여 사용한 시약, 황산지, 증류수 등에 존재 하는 질소의 양을 측정하기 위하여 같은 방법으로 실시. 이 때 소비된 0.05 N NaOH 용액의 양은 시약 + 황산지 + 증류수 등의 NH 3 와 반응한 후 수기에 남아 있는 0.05 N H 2 SO 4 용액의 양 (B). 그러므로 (B - A) 는 시료 중의 NH 3 와 반응한 0.05 N H 2 SO 4 용액의 양

7 식품분석Ⅰ - 조단백정량 시료 중의 단백질 양 계산 H 2 SO 4 ( 분자량 98 g) + 2 NH 3 ( 분자량 17 g) → (NH 4 ) 2 SO 4 H 2 SO 4 ≡ NH 3 ≡ N(=1 g 당량 ) H 2 SO 4 : N = 49 g(1 g 당량 ) : 14 g(1 g 당량 )

8 식품분석Ⅰ - 조단백정량 시료 중의 단백질 양 계산 N 14 g ≡ 1 N H 2 SO 4 1000 ㎖ (H 2 SO 4 49 g 함유 ) N 1.4 g ≡ 0.1 N H 2 SO 4 1000 ㎖ (H 2 SO 4 4.9 g 함유 ) N 0.7 g ≡ 0.05 N H 2 SO 4 1000 ㎖ (H 2 SO 4 2.45 g 함유 ) N 0.7 ㎎ ≡ 0.05 N H 2 SO 4 1 ㎖ 0.05 N H 2 SO 4 용액 1 ㎖와 반응하는 질소 : 0.7 ㎎ 조단백질 함량 (%) = 0.7 × (V0 － V1) × f × N × V × 100 S × 1000 V0 : 공 시험에서 소비된 0.05 N NaOH 용액의 ㎖ 수 V1 : 본 실험 ) 에서 소비된 0.05 N NaOH 용액의 ㎖ 수 V0-V1 : 중화반응에서 시료의 암모니아와 반응한 0.05 N 황산용액의 양. f : 0.05 N NaOH 표준용액의 농도계수, N : 시료 단백질의 질소계수 S : 시료 채취량 (g), V : 증류시 희석배수

9 식품분석Ⅰ - 조단백정량 4.1 원리 Kjeldahl 법 1) 분해 : 시료 중 질소 (N)+H 2 SO 4 →(NH 4 ) 2 SO 4 +SO 2 ↑+CO 2 ↑+CO↑+H 2 O 2) 증류 : (NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH → 2 NH 3 + Na 2 SO4 + 2 H 2 O 3) 중화 : 2 NH 3 + H 2 SO 4 → (NH 4 ) 2 SO 4 4) 적정 : H 2 SO 4 + 2 NaOH → Na 2 SO 4 + 2 H 2 O 4. 개량 Kjeldahl 법에 의한 조단백질 정량 H 2 BO 3 → (NH 4 )·H 2 BO 3 (NH 4 )·H 2 BO 3 + HCl → NH 4 Cl + H 3 BO 3 개량 Kjeldahl 법에

10 식품분석Ⅰ - 조단백정량 Kjeldahl 분해장치 Kjeldahl 증류장치

11 식품분석Ⅰ - 조단백정량 시료 중의 단백질 양 계산 (NH 4 )·H 2 BO 3 + HCl → NH 4 Cl + H 3 BO 3 (NH 4 )·H 2 BO 3 ≡ HCl (36.5g, 1g 당량 ) N ≡ HCl (1 g 당량 ) N : HCl = 14g(1 g 당량 ) : 36.5g(1 g 당량 ) N 14 g ≡ 1 N HCl 1000 ㎖ (HCl 36.5 g 함유 ) N 1.4 g ≡ 0.1 N HCl 1000 ㎖ (HCl 3.65 g 함유 ) N 0.7 g ≡ 0.05 N HCl 1000 ㎖ N 0.7 ㎎ ≡ 0.05 N HCl 1000 ㎖ (HCl 36.5 g 함유 ) 0.05 N HCl 용액 1 ㎖와 반응하는 질소 : 0.7 ㎎

12 식품분석Ⅰ - 조단백정량 조단백질 함량 (%) = 0.7 × (V1 － V0) × f × N × V × 100 S × 1000 V0 : 공 시험에서 소비된 0.05 N HCl 용액의 ㎖ 수 V1 : 본 실험 ) 에서 소비된 0.05 N HCl 용액의 ㎖ 수 f : 0.05 N HCl 표준용액의 농도계수, N : 시료 단백질의 질소계수 S : 시료 채취량 (g) V : 증류시 희석배수