경희대학교 생명과학대학 식품공학과 김 해 영 GMO 의 이해 및 검정 기술.

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1 경희대학교 생명과학대학 식품공학과 김 해 영 (hykim@khu.ac.kr) GMO 의 이해 및 검정 기술

2 I. 서론 - GMO 개발 및 관리현황 - GMO 에 삽입된 외래유전자의 특성 II. GM 식품의 검정 기술 - DNA 분석법 - 단백질 분석법 - Microarray 분석법 III. 앞으로의 전망

3 GMO (Genetically modified organism) 유전자재조합기술을 이용하여 어떤 생물체로부터 특정형질을 가진 유전자 를 다른 생물체의 염색체에 도입시켜 특정한 목적에 맞도록 만든 생물체

4 자료 : 식품의약품안전청

5 1 st -generation 2 nd -generation 3 rd -generation herbicide, insect, or virus resistance nutrient change or addition stress-tolerance

6 1994 년 무르지 않는 토마토 (Flavr Savr) 상품화 ( 칼젠 ) 1995 년 유전자변형 옥수수 재배 허가 ( 미국 ) 유전자변형 대두 재배 허가 ( 캐나다 ) 1996 년 유전자변형 작물의 상업적 재배 시작 1997 년 유전자변형 작물의 상품화 1998 년 유전자변형 밀 재배 허가 ( 캐나다 ) 2000 년 Golden Rice 개발 ( 비타민 A 강화 ) 2005 년 GM 작물 재배면적 9,000 만 ha ( 전세계 21 개국 ) 2010 년 GM 작물 재배면적 1 억 4,800 만 ha( 전세계 29 개국 )

7 Global Area of Biotech Crops Million Hectares (1996-2010)

8 Global Area of Biotech Crop, 1996 to 2010: By Trait (Million Hectares)

9 Global Area of Biotech Crops in 2010: by Country

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11 GM crops approved for Food in Korea (7 crops 76 events) Crops GM Events Soybean (7) GTS 40-3-2, MON89788, A2704-12, DP-356043-5, DP-305423-1, A5547-127, DP-305423-1×GTS 40-3-2 Maize (41) MON810, TC1507, GA21, NK603, Bt11, T25, MON863, Bt176, DLL25, DBT418, MON863×NK603, MON863×MON810, MON810×GA21, MON810×NK603, 1507×NK603, MON810×MON863×NK603, DAS-59122-7, MON88017, Bt10, MIR604, DAS-59122-7×1507×NK603, 1507×DAS-59122-7, DAS-59122-7×NK603, Bt11×GA21, MON88017×MON810, MON89034, Bt11XMIR604, DP-098140-6, MIR162 Bt11×MIR604×GA21, MIR604×GA21, MON89034×MON88017, MON89034×NK603, MON89034×TC1507×MON88017×DAS-59122-7, NK603×T25, MON89034×TC1507×NK603, TC1507×MON810×NK603, TC1507×DAS-59122-7×MON810×NK603, Bt11×MIR162×MIR604×GA21, Event3272, TC1507×MIR604×NK603 Cotton (14) 531, 757, 1445, 15985, 281/3006, 15985×1445, 531×1445, LLcotton 25, MON88913, BG2XLL, Bollgard II 15985×Roundup Ready Flex MON88913, 281/3006×88913, 281/3006×1445, GHB614, Canola (6) GT73, Ms8/Rf3, T45, MS1/RF1, MS1/RF2, Topas 19/2 Potato (4) SPBT02-05, RBBT06, Newleaf Y, Newleaf PLUS, Sugar beet (1) H7-1 Alfalfa (3) J101/J163, J101, J163

12 CropsGM Events AlfalfaJ101 Canola 23-18-17, 45A37, 46A12, GT200, GT73, HCN10, HCN92, PGS1, PGS2, MS8xRF3, NS738, OXY-235, PHY14, PHY36, T45 Carnation4, 66, 959A ChicoryRM3-3 Cotton 15985, 19-51A, 281-24-236, 3006-210-23, 31807, BXN, COT102, COT67B, DAS-21023-5 x DAS-24236-5 x MON-88913-8, Event-1, GHB614, LLCotton25, LLCotton25xMON15985, MON1445, MON15985xMON88913, MON531, MON88913 Creeping BentgrassASR368 Flax, LinseedFP967 LentilRH44 Maize 176, 3751IR, 676, B16, BT11, CBH-351, Das-06275-8, DAS-59122-7, DBT418, DK404SR, Event3272, Event98140, EXP1910IT, GA21, IT, LY038, MIR162, MIR604, MON80100, MON802, MON809, MON810, MON832, MON863, MS3, MS6, NK603, T14, TC1507 CropsGM Events MelonA Papaya55-1, X17-2 PotatoATBT04-6, BT6, RBMT15-101, RBMT21-129 PlumARS-PLMC5-6 Polish canola HCR-1, ZSR500 RiceCL121, IMINTA-1, LLRICE06, LLRICE601, PWC16 Soybean A2704-12, A5547-127, DP-305423, DP356043, G94-1, GTS 40-3-2, GU262, MON89788, OT96-15, W62 SquashCZW-3, ZW20 Sugar beetGTSB77, H7-1, T120-7 SunflowerX81359 TobaccoC, Vector 21-41 Tomato1345-4, 351N, 5345, 8338, B, FLAVR SAVR Wheat AP205CL, AP602CL, BW255-2, BW7, MON71800, SWP965001, Teal11A GM Crops in Database

13 GMO 에 삽입된 외래유전자의 특성 GMO 에 삽입된 외래유전자의 특성 Promoter Coding geneTerminator LBRB

14 pat cp4 epsps mepsps als gm-hra zm-hra csr1-2 goxv247 gat4621 gat4601 ………. 제초제내성 bar phosphinothricin-N-acetyltransferase (Streptomyces viridochromogenes) 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase (Agrobacterium tumefaciens strain CP4) modified 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase (Zea mays) acetolactate synthase (Zea mays) modified acetolactate synthase (Glycine max) modified acetolactate synthase (Zea mays) Acetohydroxy acid synthase large subunit (Arabidopsis thaliana) glyphosate oxidoreductase (Ochrobactrum anthropi) glyphosate N-acetyltransferase (Bacillus licheniformis) phosphinothricin-N-acetyltransferase (Streptomyces hygroscopicus)

15 cry1Ab cry1F cry34Ab1 cry35Ab1 cry3A cry3Bb1 cry2Ab cry3A cry1A.105 vip3Aa20 ………. 해충저항성 cry9c Bacillus thuringiensis (Bt) 대표적인 곤충병원성 토양 세균. 1901 년 이시와타 박사에 의해 누에에서 처음 발견. Bt 가 만들어내는 내독소 단백질은 곤충의 중장의 높은 pH 10~11 에서 단백질 분해효소의 작용으로 활성화되고 곤충중장 세포벽에 구멍을 내어 치사시킴. Cry 1 은 나비목, Cry 2 는 나비목과 파리목, Cry 3 는 딱정벌레목, Cry 4 는 파리목, Cry 5 는 선충에 살충효과.

16 II. GM 식품의 검정 기술

17 GMO 표시제도 사후관리 Non GMO / 유기 농산물 / 국산 농산물 표시 GMO 성분 유무 검사 ( 정성분석 ) 무표시 원료 농산물 ( 비가열 단순분쇄가공품 포함 ) 비의도적 혼입허용치 3% 이하 여부 ( 정량분석 ) 무표시 가공식품 GMO 성분 유무 검사 ( 정성분석 ) 안전성 심사 의무화 사후관리 미승인 GMO 함유 여부 ( 정성분석 ) 위해 정보 교류 ( 소비자의 알권리 보장 ) 국내 유통식품의 모니터링 시험법의 필요성

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19 PCR detection strategies P: promoter - 전사개시인자, 발현시점, 양, 부위 등의 조절 Structural gene : 제초제내성, 해충저항성 등 목적하는 유용한 단백질의 유전자 정보를 갖는 영역 (Bt toxin, EPSPS, etc.) T: terminator : 전사종결인자, 발현 조절 LB: left border, RB: right border

20 1 : 옥수수가루 2 : 팝콘용 옥수수 3 : 옥수수 통조림 4 : 과자류 5-6 : 옥수수 스프 7-9 : 과자류 10 : 옥수수 빵 11 : 영 ∙ 유아용조제식 12 : 마카로니 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M DNA 추출 PCR Agarose gel Agarose gel electrophoresis DNA 추출 확인 PCR 결과 확인

21 300 bp 250 bp 200 bp 149 bp 128 bp 99 bp 100 bp 200 bp 300 bp M 1 2 3 4 5 6 7 Multiplex PCR products amplified from 3% maize containing zein gene. 1: Zein, 2: Bt11, 3: T25, 4: Mon810, 5: Event176, 6: GA21, 7: Bt11, T25, Mon810, Event176, GA21 containing zein gene Multiplex PCR 을 이용한 5 종류의 유전자재조합 옥수수 분리

22 M1 NC PC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 300 bp 250 bp 200 bp 149 bp 128 bp 99 bp NC: Negative control; Zein(99bp), PC: Positive control; Bt11 (128bp), T25 (149bp), Mon810 (200bp), Event176 (250bp), GA21 (300bp) 1: corn flour, 2: pop corn, 3: canned corn, 4: corn soup A, 5: corn soup B, 6: corn snack A, 7: corn snack B, 8: corn snack C, 9: corn bread mix, 10: corn bread, 11: macaroni Multiplex PCR products amplified from various maize foods.

23 Real-time PCR Taqman chemistry 에 의해 표준물질의 PCR 증폭과정 중에 발 색되는 형광색소의 양을 실시간별로 측정하여 정량

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25 Strip Test

26 ELISA Test

27 ELISA 를 이용한 GMO 발현단백질 검출원리

28 Summary of methods that detect GMOs

29 DNA chip (microarray) 기술  최근 게놈 프로젝트로 대표되는 유전자 염기 서열해석의 급속한 증가로 생체 내 많은 유전자의 역할을 효율적으로 해석하기 위한 새로운 실험기법이 필요  DNA chip 은 slide glass 상에 수백 ~ 수천개의 DNA 유전자를 정렬 · 고정화한 것으로, 해석하고자 하는 세포에서 추출한 RNA 로 조제한 형광 표식 cDNA 를 hybridization 하 여 각 유전자의 발현 변화를 측정하는 방법  한 번의 실험으로 매우 많은 유전자의 발현정보를 얻을 수 있으며, 게놈 해석에서 얻은 유전 자구조정보를 바탕으로 체계적인 발현 해석을 위한 강력한 screening tool 로 이용

30 Promoters Genes terminators The Genetic components introduced into GM crops approved worldwide

31 Target DNA preparation Probe DNA preparation PCR Labeling Spotting & Printing Cy3-labeled PCR products 5'-amine-modified oligonucleotide Hybridization Image analysis Microarray-based Detection System for GMO

32 Specificity of 8 different events of GM Maize

33 84 laboratories from 36 countries Validation of GMO detection method

34 III. 앞으로의 전망

35 GMO Contamination Issues Illegal Rice Bt63 from China Contaminated Food Products in April 2005 Genetically engineered rice seeds have been sold and grown commercially for a number of years in central China’s Hubei province. Contamination have been found in wholesale market and unpackaged rice in supermarkets. (e.g. Baby food) Unapproved GM rice owned by Bayer CropScience were found in US rice exported (2006~2007) None of the contaminating varieties had approval for cultivation or consumption anywhere else in the world Rice supplies of 30 countries were contaminated with Bayer's unapproved GE varieties

36 GMO Contamination Issues  European tests confirmed Canadian flax was contaminated with the CDC Triffid flax in July 2009 GM flax is not approved for human consumption in 28 countries including Korea where contamination has now reached In Korea, origin of imported flax confirmed Canada → Reliable GM detection method for flax is required

37 2009/04/10 533 품목 등록 GM microorganism 11 GM papaya 1 GM tomato 3 GM sweet pepper 3, 미승인 GMO 재배현황조사 2009/03/31 22 작물, 132 품목 밀 7, 벼 5, 호박 2, 토마토 6, 파파야 1, 멜론 1

38 Unknown Event Identification i i Screening element identification 1 Amplification of intervening sequence between elements 2 Amplicon sequencing 3 Direct evidence of unknown event identification 4 - The high-performing 35S promoter is a common feature to many GMOs. - The stop signal for gene transcription in most GMOs the NOS terminator. promoterTarget geneTermnator

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