화공생명공학과 2 0 0 3 1 2 6 0 정 정 구. Contents 1. 실험 구성 (3 단계 ) 2. 실험 방법 ( 각 단계별 방법 ) 3. 실험 결과 4. 결과 토의 5. 참고 문헌.

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1 화공생명공학과 2 0 0 3 1 2 6 0 정 정 구

2 Contents 1. 실험 구성 (3 단계 ) 2. 실험 방법 ( 각 단계별 방법 ) 3. 실험 결과 4. 결과 토의 5. 참고 문헌

3 1. 실험 구성 1 단계 세포에서 DNA 추출 2 단계 PCR 이용, DNA 양 늘림 3 단계 DNA Agarose gel electrophoresis 통해 분석

4 2. 실험 방법 – 1 단계  대장균 (E.coli) 세포에서 DNA 추출하는 단계  세포를 침전시켜 TNE 완충용액을 이용 해 셀벽을 약화, 얼음물을 이용해 세포에 충격, 페놀을 이용해 DNA 와 RNA 만 남기 고 나머지 단백질을 엉기게함, 회전교반 기를 이용해 원심분리, 상등액을 취해 잔 여물질 제외하고 DNA 농축시킴, RNase A 를 첨가해 RNA 를 없애고 DNA 만 남김.  최근에는 Kit 한방으로 DNA 를 추출. 원심분리기 사용시 무게 배분에 주의 !!

5 2. 실험방법 – 2 단계  PCR 을 이용, DNA 양을 늘이는 단계. DNA 의 변성 (denaturation)  1) DNA 의 변성 (denaturation) - 열을 가해 Double strand DNA 를 Single strand DNA 로 만든다. ( 약 94 ℃ ) Primer 의 결합 (annealing)  2) Primer 의 결합 (annealing) -Tm 값인 50 ℃～ 65 ℃사이에서 Primer 와 Single strand DNA 와 결합 (62 ℃ ) DNA 의 합성 (polymerization)  3) DNA 의 합성 (polymerization)  -70 ℃～ 74 ℃에서 DNA 의 개수를 늘림.

6 2. 실험방법 – 2 단계  2 단계 Annealing 에 사 용되는 온도식 Tm = (4 x [G+C] + (2 x [A+T])  2 단계와 3 단계를 순환 식으로 30 회정도 진행  2 단계와 3 단계를 순환 식으로 30 회정도 진행 하여 DNA 가닥수를 늘 린다. PCR 진행 과정

7 2. 실험방법 – 3 단계  DNA 를 Agarose gel electrophoresis 를 이 용해 분석하는 단계.  1) Agarose gel 은 전기전도성을 가진 TAE Buffer 에 Agar 를 넣고 가열 후 식힘, DNA 염색용액인 EtBr 주입, holder 에 붓고 젤 형태로 굳힘.  2) DNA 는 인산기로 인해 음극의 성질을 가짐. 전기영동기에 굳은 Agarose gel 의 홈이 있는 쪽을 음극 쪽으로 꽂는다. EtBr 은 강력한 발암물질 이므로 사용에 주의 !!

8 2. 실험방법 – 3 단계  3) 첫 번째 홈에 Size marker 용도의 ladder 주입 ( 일본 Takara 사의 ladder)  4) 우리가 확인해야 할 DNA 와 loading dye 를 섞어 나머지 홈에 주입.  5) 전기를 흘려 전기 영동함.  6) 충분한 시간이 지난 후 젤을 꺼내 UV 광학기로 분석. UV 를 직접 눈으로 보면 실명 위험 !!

9 3. 실험 결과  1 번 – Ladder  2 번 – mgsA  3 번 – mgsA  4 번 – gldA  5 번 – gldA  6 번 – gldA UV 광학기로 찍은 형광띄 사진

10 3. 실험 결과  Takara 사에서 제공한 Size marker 에 비 교해본 결과 2,3 번은 0.5kb(500bp) 를 가 진 DNA 이고, 4,5,6 번은 1kb(1000bp) 를 가진 DNA 이다.  2,3 번은 0.458kb(458bp) 의 염기를 가진 mgsA 이다.  4,5,6 번은 1.104kb(1104bp) 의 염기를 가 진 gldA 이다.

11 3. 실험 결과  NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 에서 찾은 mgsA 의 정보는 다음과 같다.http://www.ncbi.nlm.nih.gov  Gene name : mgsA  Primary source : ECOCYC:G6497  Gene type : protein coding  Organism : Escherichia coli K12 (strain: K-12, substrain: MG1655)  Product : methylglyoxal synthase

12 3. 실험 결과 mgsA 의 염기서열은 다음과 같다 mgsA 의 염기서열은 다음과 같다 atggaactga cgactcgcac 1 atggaactga cgactcgcac tttacctgcg cggaaacata ttgcgctggt ggcacacgat 61 cactgcaaac aaatgctgat gagctgggtg gaacggcatc aaccgttact ggaacaacac 121 gtactgtatg caacaggcac taccggtaac ttaatttccc gcgcgaccgg catgaacgtc 181 aacgcgatgt tgagtggccc aatggggggt gaccagcagg ttggcgcatt gatctcagaa 241 gggaaaattg atgtattgat tttcttctgg gatccactaa atgccgtgcc gcacgatcct 301 gacgtgaaag ccttgctgcg tctggcgacg gtatggaaca ttccggtcgc caccaacgtg 361 gcaacggcag acttcataat ccagtcgccg catttcaacg acgcggtcga tattctgatc t cgcggaccgt ctgaagtaa 421 cccgattatc agcgttatct cgcggaccgt ctgaagtaa

13 3. 실험 결과  mgsA 의 Primer 를 20mer 로 짰다. ( 앞페이지 염기서열 진한부분 )  Upstream primer  Upstream primer 5' -ATggAACTgACgACTCgCAC- 3' Tm = (4 x [5+6] + (2 x [6+3]) = 62 ℃  Downstream primer  Downstream primer 5' -TTACTTCAgACggTCCgCgA- 3' Tm = (4 x [5+6] + (2 x [4+5]) = 62 ℃

14 3. 실험 결과  gldA 의 정보는 다음과 같다.  Gene name : gldA  Primary source : ECOCYC:EG11904  Gene type : protein coding  Organism : Escherichia coli K12 (strain: K-12, substrain: MG1655)  Product : glycerol metabolism

15 3. 실험 결과  gldA 의 염기서열은 다음과 같다. atggaccgca ttattcaatc  1 atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt  61 ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt  121 ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa  181 attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg  241 gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc  301 aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc  361 gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat  421 ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca  481 cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt  541 gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg  601 gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct  661 gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatttg  721 agcggtgttg gttttgaaag tggtggtctg gctgcggcgc acgcagtgca taacggcctg  781 accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg  841 acgcagctgg ttctggaaaa tgcgccggtg gaggaaatcg aaaccgtagc tgcccttagc  901 catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg  961 aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct  1021 ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag tcctgc aagagtggga ataa  1081 cgtttcctgc aagagtggga ataa

16 3. 실험 결과  gldA 역시 Primer 는 20mer 로 짰다. ( 앞페이지 염기서열 진한부분 )  Upstream primer  Upstream primer 5' -ATggACCgCATTATTCAATC- 3' Tm = (4 x [3+5] + (2 x [6+6]) = 56 ℃  Downstream primer  Downstream primer 5' -TTATTCCCACTCTTgCAggA- 3' Tm = (4 x [3+6] + (2 x [4+7]) = 58 ℃

17 4. 결과 토의  G+C 비율이 1:1 로 디자인  G+C 비율이 1:1 로 디자인 하는 것이 primer 와 template 간의 결합력을 강하게 함. annealing 온도를 비슷하게  양쪽 primer 의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 함.(Tm)  양쪽 primer 가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 비특이 DNA 가 생성 되지 않도록 고안해야 함.  Primer 의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무 의 90% 를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합 성하기 전에 신중히 고려해야 함.

18 4. 결과 토의  G,C 의 개수와 길이를 일치시켰다.  primer 의 길이를 20mer 로 맞추었음.  primer 의 annealing 온도가 다르면 반응 에 지장이 생기므로 모두 Tm = 62 ℃로 맞 춤.  gldA 의 경우 Tm 값 맞추기 어려움. 임의 의 염기 서열을 추가하거나 primer 의 길 이를 늘이거나 줄이는 방법을 이용해서 맞춰야 함.

19 4. 결과 토의  수정된 gldA 의 염기서열 ( 밑줄친 부분이 삽입부분 ) gcgatggaccgca ttattca  1 gcgatggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt  61 ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt  121 ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa  181 attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg  241 gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc  301 aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc  361 gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat  421 ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca  481 cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt  541 gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg  601 gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct  661 gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatttg  721 agcggtgttg gttttgaaag tggtggtctg gctgcggcgc acgcagtgca taacggcctg  781 accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg  841 acgcagctgg ttctggaaaa tgcgccggtg gaggaaatcg aaaccgtagc tgcccttagc  901 catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg  961 aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct  1021 ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag tgc aagagtggga ataaccc  1081 cgtttcctgc aagagtggga ataaccc

20 4. 결과 토의  수정된 gldA 분석  Upstream primer 5' -gCgATggACCgCATTATTCA- 3' Tm = (4 x [5+5] + (2 x [5+5]) = 60 ℃  Downstream primer 5' -gggTTATTCCCACTCTTgCA- 3' Tm = (4 x [4+6] + (2 x [3+7]) = 60 ℃ 수정된 gldA 는 이전보다 G,C 의 개수가 맞고, Tm 값이 60 ℃로 일치.

21 5. 참고 문헌  Reiner Westermeier, Electrophoresis in Practice 3ed, Wiley- VCH, p7~14, p15~18, p20, p129~140, p330, (2001)  Kennets, W. Siggens : Polymerase Chain Reaction for the Detection of Listeria Species and Listeria monocytogenes Method in molecular Biology, Vol. 46, p236~246  Campbell Farrell, Biochemistry5ed, Thomson, p215~326(2005)  전기영동 원리 및 영동 pattern 해석, 권오헌, 이귀녕, 도서출판 의학 문화사, p16(2002)  손기남, 홍남주, 생물유기화학, 미학사, p375~386, (2001)  김병홍, 미생물 생리학, DNA 함성 아카데미 서적, p168~178, (1996)  수원대 연구실, http://dragon.seowon.ac.kr/~bioedu/bio/ch12.htm  분자생물학을 위한 워크샵, http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/PCR.php

22 끝.끝.끝.끝.  경청해 주셔서 감사합니다.