이 시 원 Microbial Ecology Lab. Dep. of Microbiology Dankook Univ.

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1 이 시 원 Microbial Ecology Lab. Dep. of Microbiology Dankook Univ.

2 전자현미경 수업 ( 대학원 ) - 생명과학과 문명진 교수님 ( 발생분화 실험실 ) - 2010 년 9 월 7 일 - 11 월 2 일 ( 매주 화요일, 오후 3 시 20 분 - 5 시 10 분 ) - 총 8 회 수업 중 (introduction 제외 ) 7 회 수업 참석 - 앞으로 4 주 → 전자현미경에 관한 프리젠테이션, 계속 참가예정

3 투과전자현미경 ? - 고전압의 전자 빔을 쏘아 얇게 자른 생물의 조직을 투과하게 함으로써 수십만 배 이상으로 확대하여 관찰할 수 있는 현미경 주사전자현미경 ? - 생물체 조직의 표면에서 반사되는 전자 빔을 사용하여 고배율의 입체적인 상을 관찰할 수 있게 한 현미경

4 Part 1. TEM 시료의 제작 Part 2. TEM 사용방법 전자현미경 관찰을 위한 준비 조직의 해부 (Extraction) 조직의 고정 (Fixation) 수세 (Washing) 탈수 (Dehydration) 포매 (Embedding) 절편제작 (Sectioning) 초박절편의 신전과 부착 (Flattening & Mounting) 염색 (Staining) 필름 현상 및 인화 (Developing & Printing)

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6 전자현미경 관찰을 위한 준비 1. Osmium tetroxide(OsO 4 ) 앰플과 OsO 4 sol. 을 보관한 시약병 (glassware) 를 glassware cleaning sol. 에 처리 → 화학적 청결상태유지 2. 작업 2-3 일전에 필요한 양 만큼의 dehydrating sol. 을 준비 ( 탈수과정 ) 조직의 해부 1. 마취 2. 생리식염용액 3. 조직의 크기 Glassware cleaning solution 1. Potassium dichromate100 g 2. DW1,000 ml (Heating and stirring until solution dissolves, cool to room temperature) 3. Concentrated sulfuric acid (H 2 SO 4 )100 ml

7 조직의 고정 고정이란 조직에 화학변화를 일으켜 안정한 물질로 변화시키는 것이 목적 ( 조직을 형태적 변화 없이 죽이는 과정 ) 1. 고정 시 고려해야 할 사항 1) 적정 pH 유지 2) 적정 온도유지 : 0-4 ℃의 저온에서 행하는 것이 일반적 ( 단백질 변성방지 ) 3) 적정 삼투압 유지 4) 적정 고정시간 유지 5) 고정액의 양은 조직절편의 20-50 배 유지 2. 고정액의 종류 1) Aldehyde 계통의 유기고정액 2) Osmic acid 나 potassium permanganate 같은 금속고정액의 두 종류가 사용

8 3. 고정 (Fixation) 과정 1) 전고정 (Prefixation) ① Glutaraldehyde ② Formaldehyde(=Paraformaldehyde) ③ Paraformaldehyde-Glutaraldehyde mixture 2) 후고정 (Post-fixation) ① Osmium acid : 조직의 세포구조와 세포 성분을 생체조직과 거의 같은 상태로 보존 세포운동을 감소시켜 세포의 수축을 방지. 단, 침투속도가 느림 (0.5mm/hour). 가격도 매우 비싼 편 (100,000 원 /g). ② Potassium permanganate : 이 고정액을 사용하여 고정한 조직의 경우 OsO 4 를 사용 한 것에 비해 명확한 전자현미경상을 얻을 수 있음 생체막구조나 glycogen 등의 관찰할 때 뛰어나며, ribosome 의 관찰에는 효과가 좋지 않다. - 고정액은 동량의 완충용액으로 식물조직은 pH 6.8-7.0, 동물조직은 pH 7.2-7.4 일반적으로는 phosphate buffer 사용 / cacodylate buffer 는 우수하나 가격이 비쌈 ※ Osmium acid 사용 시 주의사항 - 강한 독성을 가지고 있음 ( 증기만으로도 치명적 ) - 유발물질, 기형 유발물질, hood 내 사용 - 늦어도 사용하기 하루 전에 2-4% 제조 ( 용해되는 속도가 매우 느리기 때문 ) - 갈색병에 담아 냉장보관 - 마개를 반드시 밀봉 ! 냉장고 내부를 검게 변색 Paraformaldehyde-Glutaraldehyde 1. Paraformaldehyde2 g DW25 ml (Boiling, and adjust final volume to 12 ml) 2. Glutaraldehyde4 ml DW8 ml 1+2, and add 0.2M phosphate buffer 24 ml, final volume 48 ml

9 수세 (washing) “ 고정한만큼 washing 하라 ” 라는 격언 - 고정이 끝난 조직의 내부에 남아있는 여분의 고정액을 완전히 제거하기 위해 실시 - 고정 시 사용한 완충용액을 저온처리 (4 ℃ ) 하여 15-20 분 간격으로 2-3 회 정도 실시 - 수세 시, 적정 삼투농도유지에 주의 - 너무 오랜 시간이 경과 → 고정용액에 의해 형성된 cross-link 가 분해 탈수 (Dehydration) - 조직내부에 함유된 수분을 제거하는 과정 ( 조직 속의 액체들이 아세톤 or 에탄올로 바뀜 ) - 수분은 물론 embedding medium 과도 친화력있는 acetone 을 사용하여 탈수 - 에탄올을 사용할 경우, 아세톤 or 강한 유기용매인 propylene oxide 로 치환 ① Acetone method ② Ethanol method ③ Acetone-Ethanol method

10 포매 (Embedding) 고정과 탈수과정이 끝난 조직은 초박절편 (ultra-thin section) 을 제작하기 위하여 적절한 포매제 (enbeding medium) 에 의해 완전하고 균일하게 침투 1) 침투 (infilteration): 조직 내부에 용존 되어있는 탈수용액을 포매제로 점진적으로 대체 2) 포매 (embedding) 3) 중합 (polymerization) ① 열중합 - 방법 1. 30 ℃ -12 h / 45 ℃ -12 h / 60 ℃ -24 h - 방법 2. 45 ℃ -12 h / 60 ℃ -24 h - 방법 3. 60 ℃ -28 h ② 자외선 중합 : 특수한 실험목적 ① Ethanol method : 탈수용액으로 ethanol 을 사용, propylen oxide 로 치환 [E:P=1:1(15 min, 1 반복 ) → P(15 min, 2 반복 ) → P:Epon=3:1(15 min, 1 반복 ) → P:Epon=1:1(30 min, 1 반복 ) → P:Epon=1:3(15 min, 1 반복 ) → Epon(60 min, 1 반복 )] ② Acetone method : 탈수용액으로 acetone 을 사용, acetone-Epon mixture 로 침투 [A:Ep=3:1(15 min, 1 반복 ) → A:Ep=1:1(30 min, 1 반복 ) → A:Ep=1:3(15 min, 1 반복 ) → Epon(60 min, 1 반복 )] ① 포매제의 조건 - 조직 내 침투 시 세포성분을 추출하는 성질이 없어야 함 - 탈수용액이나 치환제에 쉽게 용해되어야 함 - 조직 내 침투가 용이하도록 점도가 낮아야 함 - 중합 반응 시 부피 변화가 거의 없어야 함 - 관찰 시 전자선에 안정 - 절편 제작이 쉽고, 제작된 초박절편이 균일 - 초박절편제작이 가능 (50 nm 이하 ), 염색성이 좋아야 함 - 미세규조 보존능력이 우수 - 값이 싸고 구입이 용이 ② 포매제의 종류 - 불수용성 포매제 : Methacrylate regins, Epoxy regins 및 Polyester regins - 수용성 포매제 : Durcupan, Glycol-methacrylate, Gelatin,, Polyethylene glycol 및 Aquon epon ( 예 ) Durcupan 과 Araldite 사용 방법 ③ 포매용 시약의 구성 - 포매제 (embedding medium) : 수용성, 불소용성 포매제가 속함 - 경화제 (hardner) : 포매제의 수지 분자와 반응하여 cross link 를 일으킴 - 가속제 (accelerator, catalyst) : 포매제와 경화제의 반응을 촉진 - 연화제 (modifier, plasticizer, flexibilizer) : Blook 이 경화되어 너무 단단해지는 것을 방지 ④ 포매방법 - 포매용 시약은 서로 잘 섞이므로 다른 종류의 수지를 함께 사용 - 현재 가장 널리 사용되는 방법 : Epon 812 와 Araldite 의 혼합액

11 절편제작 (Sectioning) 시료는 전자선의 투과한계 때문에 매우 얇은 절편을 제작해야 관찰이 가능 조직이 포매되어 중합반응이 끝난 block 을 triming 한 후, ultramicrotome 이라는 정밀기계와 유리칼을 사용하여 적정한 두께로 잘라냄으로써 이루어짐 1. 유리칼 1) 제작 2) 검사 3) 물받이 부착 4) 보관 ① 유리칼은 사용하기 직전에 제작하는 것이 가장 바람직 ② 보관 시, 먼지가 없는 유리나 플라스틱 상자 속에 넣어 보관 ③ 물리적 충격이 가해지지 않도록 조심 ④ 제작한지 오래된 유리칼은 semithin section 에만 사용 2. 환경조건 1) 온도 : 20-23 ℃정도가 적당 2) 습도 : 가장 민감한 요소, 항상 50-60% 이하 3) 진동 : 초박절편제작기는 진동이 가장 적은 방을 선택 4) 먼지가 발생하지 않도록 주의 3. Block triming

12 유리칼 제작 과정

13 준초박절편 (Semi-thin section) 제작 초박절편을 만들기 전 반드시 준초박절편을 제작, 광학현미경하에서 관찰 1. 절편의 두께 : 보통 1.0-1.5 ㎛ 2. 절편을 slide glass 로 옮김 : 눈썹, loop 이용 3. 신전 (flattening) 과정 - 증류수 몇 방울 위에 절편을 올리고 60 ℃정도로 조정된 multi plate 등을 이용 → 절편이 glass 에 고착, 건조됨 4. 염색 : methylene blue 나 toluidine blue 로 염색 5. 보관 : 먼지를 방지할 수 있는 상자에 넣어 보관

14 초박절편 (Ultra-thin section) 제작 1. 초박절편기의 종류 : 전자식, 기계식 및 열팽창식 2. 절편의 두께에 따른 색 ※ 120 nm 이하, 아무도 없는 새벽 3-4 시 진동이 없을 때 가장 잘 이루어짐 3. 초박절편의 신전과 부착 1) Grid ① Grid 는 광학현미경에서 slide glass 의 기능 ② 직경 3 mm 의 원형, 100 mesh, 200 mesh, 300 mesh 등 ③ 재질은 구리, 니켈, 황금, 백금 등이 사용 ④ 친수화 용액에 grid 를 담근 후 사용 ( 알코올이 or 아세톤에 담가두었다가 사용하는 방법이 일반적 ) ⑤ 초박절편을 grid 에 부착

15 염색 (Staining) 일반적으로 전자염색이란, 세포 또는 조직의 미세구조를 투과전자현미경으로 관찰 하기위해 전자밀도 (electron density) 또는 contrast 를 높여주는 과정을 말함 1. 염색 시약 1) Uranyl acetate solution 2) Lead citrate solution ※ 염색시약은 모두 환경에 유해하므로 주의, 안전하게 처리 2. 염색과정 1) Uranyl acetate solution 은 filtering 후 사용, 염색하고 암소에서 20 분 반응 ( 빛에 민감 ) 2) Lead citrate solution 은 탄산에 민감하여 NaOH 를 적당량 넣고 그 안에서 염색 전자현미경 필름의 현상 및 인화 1. 오래된 모델이라 인화 2. 필름 현상액, 인화지 현상액, 정지액 및 정착액 사용하여 인화

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