중합효소연쇄반응 (PCR). Polymerase Chain Reaction (PCR)  중합효소연쇄반응  주형 DNA 분자의 특정 부분을 선택적으로 증폭 Primer set 와 내열성 DNA polymerase 를 이용하여 짧은 시간 내에 미량의 시료에서  Kary.

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1 중합효소연쇄반응 (PCR)

2 Polymerase Chain Reaction (PCR)  중합효소연쇄반응  주형 DNA 분자의 특정 부분을 선택적으로 증폭 Primer set 와 내열성 DNA polymerase 를 이용하여 짧은 시간 내에 미량의 시료에서  Kary Mullis 1983 (1985) 1993, Nobel Prize in Chemistry

3 PCR 에 필요한 것들  주형 (Template) contain the DNA region (target) to amplify  Primer set  forward & reverse primer  oligonucleotide  complementary to the 3’ ends of each of the strand of the DNA target  내열성 DNA 중합효소 with a temperature optimum at around 70°C  dNTPs  Thermal cycler (PCR machine)

4 중합효소연쇄반응의 단계  Denaturation (DNA 변성 )  strand separation  94 ℃, 0.5 ~ 1 min  Annealing ( 프라이머 결합 )  complementary pairing (Template – Primer)  55 ℃, 1 min (Temp. must be adjusted)  Extension/Elongation (DNA 의 신장 )  Enzymatic DNA replication  Heat stable DNA polymerase (Taq polymerase)  72 ℃, 1 min  Initial denaturation : 94 ℃, 5 min Final Extension : 72 ℃, 5 min

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6 Thermal cycler For repeated heating and cooling

7  After 10 cycles : 2 10 = 1,024 20 cycles : 2 20 = 1,048,576 30 cycles : 2 30 = 1,073,741,824

8 Applications of PCR  임상 (Diagnosis of diseases) 병원균의 감염 여부 ( 배양이 어렵거나 불가한 병원균 ) 유전병의 존재 여부, 유전자 돌연 변이 여부 암의 발병 진단 또는 발병 가능성 예측  DNA 증폭 및 정량 (Amplification and quantification) 법의학 (Forensic analysis) : Genetic fingerprinting 고생물학, 고고학 계통발생학적 분류 (phylogenetic tree) : 16S rDNA, 유전자의 발현 여부 및 발현 정도 결정 (Quantitative PCR, Real time PCR)  돌연변이 유도 위치지정 돌연변이 (Site-directed Mutagenesis) Error-prone PCR

9 Limitations of PCR  염기서열이 알려진 DNA 만을 증폭할 수 있음  Primer 제작에 필요함  Random primer  Target DNA sequence 이외에 시료에 오염된 DNA 도 증폭 가능  1 분자의 DNA 도 증폭 가능함  염기서열이 바뀐 산물 생성 가능  Taq DNA polymerase : prone to error  유전자 원으로 사용할 경우 염기서열 확인 필수  Error-prone PCR for mutagenesis

10 DNA polymerase for PCR  Klenow fragment of DNA polymerase I  Heat stable DNA polymerases  Taq polymerase (Thermus aqaticus) Relatively low replication fidelity Lack of 3' → 5' exonuclease proofreading activity Size limit : < 2 kb  Pfu DNA polymerase : Pyrococcus furiosus proofreading activity  Tth DNA polymerase : Thermus thermophilus  Deep Vent TM DNA polymerase : Pyrococcus sp.  Deep Vent TM (exo-) DNA polymerase : Pyrococcus sp.

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12 Primers for PCR  Primer set  oligonucleotide  Forward primer, Reverse primer  증폭 부위의 3’ 말단에 상보적이어야 함  Important design considerations  Primer Length : 17 ~ 22 bp  Primer G+C content : 40 ~ 60%  Primer Melting temperature (T m )  Primer Annealing Temperature (T a )  Primary Secondary Structures : (X : Hairpin, Self dimer, Cross dimer)

13 Optimization of PCR  Primer Length : 17 ~ 22 bp  Long enough for adequate specificity Short enough for primers to bind easily to the template at the annealing temperature  8-mer : primer 의 결합부위는 평균 4 8 = 65,536 bp 당 한 번 (human genome 3,2000,000 kb, 49,000 개 존재 )  17-mer : 4 17 = 17,179,869,184 bp 당 한 번 (human genome 의 한 부위에서만 결합 )

14  GC Content : 40 ~ 60%  Primer Melting Temperature (T m ) : 52 ~ 58 ℃  indicate the duple (DNA-DNA hybrid) stability  critical in determining the annealing temperature  Forward primer 와 reverse primer 의 T m 이 비슷해야 함  T m = (4 x [G + C]) + (2 x [A + T]) ℃ (nucleotide 의 개수 )

15  Primer Annealing Temperature (T a ) :  Too high T a insufficient primer-template hybridization low PCR product yield  Too low T a high number of base pair mismatches non-specific products (low PCR specificity)  Determined experimentally Tm - (1 ~ 5 ℃ ) Opt. T a = 0.3 x T m (primer) + 0.7 T m (product) – 14.9

16  Primer Secondary Structures  by intermolecular or intramolecular interactions  Hairpin : intramolecular Self dimer : intermolecular, F-F, R-R Cross dimer : intermolecular, F-R  adversely affect primer template annealing can lead to poor or no yield of the product

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18 Cross-Dimer

19  Length of the Target 0.1 kb ~ 3 kb (~ 1 kb) ~ 10 kb, ~ 40 kb  Buffer solution  Bivalent cations : generally Mg 2+ is used Mn 2+ can be used for PCR-mediated DNA mutagenesis  Monovalent cation potassium ion (K + )

20  http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g

21 Cloning of PCR products  TA cloning  Taq, Tth : PCR product 의 3’- 말단에 A 첨가  T vector 사용  제한효소 자리가 있는 primer 를 사용하는 방법  Primer 의 5’ 방향에 restriction site 를 가진 oligonucletide 가 결합된 primer  PCR product 를 제한효소로 처리 후 vector 에 삽입  Topoisomerase 와 연결된 vector 를 이용하는 방법

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