Howard Mould Count Method 하워드곰팡이계수측정법

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1 Howard Mould Count Method 하워드곰팡이계수측정법

2 Section I. 하워드몰드 검사방법

3 1.하워드몰드 계수측정 Chamber 그림1. Howard mould counting chamber

4 Chamber와 cover glass는 비눗물, 암모니아수 희석액 또는 알코올에 담근 후 렌즈용 천으로 닦아서 말린다.
위에서 세척한 chamber와 cover glasss의 청결한 정도는 chamber에 cover glass를 올려놓고 chamber의 양 쪽 턱(shoulder)을 누른 다음 빛에 반사시켜 무지개색(newton’s ring)이 나타나는지를 통해 확인한다. ※단, chamber에 teflon코팅이 되어 있는 경우 확인할 필요가 없다.

5 3.시료의 준비과정 + 5% 안정액 25ml 시약 -1% NaOH : ready to use
Silica gel 소포제 또는 2-octanol : ready to use 5% 안정액 : 고속 교반기에서 85℃ 물 475㎖을 넣고 25g의 팩틴을 조금씩 넣으며 용해시켜 만든다. 10,000rpm 10,000rpm + 고추가루 시료 5g + 1% NaOH 30㎖ Silicagel 또는 2-octanol3~4방울을 첨가해 거품을 제거한다. 10,000rpm에서 5초간 혼합 1%NaOH 70㎖로 혼합기 내벽의 부착물을 씻어내리고 10,000rpm에서 3분간 혼합한다. 5% 안정액 25ml 약 800㎕시료를 하워드곰팡이계수 슬라이드에 점적 하여 관찰한다..

6 오른쪽의 사진과 같이 적당한 도구를 사용하여 시료를 chamber에 올려놓되 마이크로 피펫을 사용해도 무방하다.
※단, 시료를 접정할 때는 한 번에 한다. 올려놓은 시료가 모자란다고 해서 절대 더해서는 안 된다. 이 과정은 여러 차례 연습을 통해 숙달하도록 한다. 사진1. 시료 접정법

7 오른쪽 사진과 같이 cover glass를 장치한다.
※너무 빠르게 덮으면 시료가 shoulder로 흘러나오게 되고, 너무 느리면 시료가 골고루 퍼지지 않게 된다. 사진2. Cover glass 걸치법

8 6.검경 전 체크할 내용 각 필드(전체 25개 중)에서 검사할 시료는 현미경상에서 매우 적은 양(1/250 drop)이기 때문에 정확한 데이터를 얻기 위해서는 다음의 사항을 체크한다. Newton’s ring – 본 제품은 teflon 코팅이 되어있기 때문에 생략한다. 시료의 불균등한 분포 – 이 경우 곰팡이 균사가 한 쪽으로 모여있을 수 있다. 골(moat)과 턱(shoulder)에 시료의 유무 – 골 또는 턱에 시료가 흘러나와 있으면 cover glass가 제 위치에 자리잡을 수 없다. 공기방울 – Chamber에 공기방울이 들어가 있으면 현미경상에서 곰팡이로 오인하고, 양성판정을 내릴 수 있다. 위의 사항 중 하나라도 발견되면 chamber를 세척하여 다시 제작한다.

9 7.현미경 규격 조절 Chamber의 검경 부분의 왼편에(그림1의 경우 오른편) 두 개의 미세한 선이 보이는데, 이것을 기준으로 현미경 시야(field)를 조절한다 field가 적절하게 조절이 되면 두 기준선과 접하게 된다. Micrometer를 장착하고 field안에 총 36개의 격자가 외접해 보이도록 조절한다. 위와 같이 조절하면 field는 직경 1.382mm가 된다. 관찰자 X10 X10 Micrometer를 장착한 상태에서 본 field(녹색부분) 그림2. Stage위의 chamber 그림3. 관찰자 시점 1.382mm

10 ※25개의 field는 규칙적으로 그리고 균사의 유무에 관계없이 선정하는 것이 필수적이다.
8.계수측정의 패턴 그림4와 같이 임의의 25개 관찰할 위치를 정해두고 붉은색 화살표와 같은 패턴으로 움직여서 관찰하는데 혼란이 생기지 않도록 한다. ※25개의 field는 규칙적으로 그리고 균사의 유무에 관계없이 선정하는 것이 필수적이다. 그림4. 계수측정 패턴

11 같은 샘플을 2회에 걸쳐 검사하는 것을 원칙으로 한다.
10. 계산방법 같은 샘플을 2회에 걸쳐 검사하는 것을 원칙으로 한다. 양 성 필 드 관찰한 필드(50개 필드) X 100 = 샘플당 양성비(%)

12 Section II. 곰팡이 균사체의 현미경 사진
파괴된 균사, 혹 그리고 분지된 균사의 실사 파괴된 균사

13 온전한 상태의 균사 – 세포벽이 평행하고, 격벽, 분지된 모습을 볼 수 있다.

14 분지된 상태의 균사로 세포벽이 견고하게 보인다.
또한 화살표가 가리키는 부분은 둥근 모양으로 이것은 성장하여 분지된 것을 보여준다. 균사체와 혼동할 수 있는 조직의 모습. 화살표가 가리키는 곳을 보면 끝이 풀어진 모습이고, 세포벽이 울퉁불퉁하다