세포투과 펩티드를 이용한 펩티드, 단백질 및 핵산전달기술 충 북 대 학 교 나노화공소재연구실 정 충 훈

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1 세포투과 펩티드를 이용한 펩티드, 단백질 및 핵산전달기술 충 북 대 학 교 나노화공소재연구실 정 충 훈
2008년 11월 26일 생의공학 발표 (p.p 211~233) 세포투과 펩티드를 이용한 펩티드, 단백질 및 핵산전달기술 충 북 대 학 교 나노화공소재연구실 정 충 훈

2 Contents 2-4 생리활성 거대분자의 2-1 개 요 세포내 전달 2-2 세포투과 펩티드 2-5 결 론 2-3 세포투과기작
2-2-1 TAT 2-2-2 Antp 2-2-3 HSV-1 단백질 VP22 2-2-4 아르기닌올리고머 2-2-5 기타 펩티드 2-3 세포투과기작 2-4 생리활성 거대분자의 세포내 전달 2-4-1 단백질 2-4-2 핵 산 2-4-3 항 체 2-4-4 나노입자 2-4-5 기타 분자 2-5 결 론

3 단 백 질 (protein) 2-1 개 요 ① 신호전달 ② 세포내 대사 ③ 세포의 구조에 있어서 핵심적인 역할을 담당.
2-1 개 요 단 백 질 (protein) 세포막 또는 세포내 기관에 다량으로 존재하며 ① 신호전달 ② 세포내 대사 ③ 세포의 구조에 있어서 핵심적인 역할을 담당.

4 단백질, 핵산과 같은 수용성 거대분자의 세포내 투과 방해
세포막 (인지질 이중층)

5 리 소 좀 분 해 세포내 전달과정 세포막 엔도솜 (식포) 형성 효소작용 외부물질 세포질 핵 엔도시토시스 (내포작용)
엔도시토시스 (내포작용) 외부물질 세포질 세포막 엔도솜 (식포) 형성 핵 세포내 전달과정 리 소 좀 효소작용 분 해 세포가 물질(단백질과 같은 분자)을 밖으로부터 안으로 세포막을 이용하여 삼키는 작용을 말한다. 식포라고 알려진 액포가 물질을 감싸서 세포 안으로 운반한 뒤 세포 안에서 분해한다. 주로 세포가 영양분 등을 흡수하기 위해 사용. 빨아들인 물질을 세포 원형질막을 둘러싼것을 엔도솜이라고 하죠. 이 엔도솜과 리소좀이 결합해서 물질을 분해 리소좀 : 가수 분해 효소를 많이 가지고 있어서, 세균 등의 이물질을 소화하는 역할을 한다. 세포질 중에서 볼 수 있다.

6 제품개발 초기단계 문제점 선행 해결책 세포내로 전달된 거대분자의 생체내 실험시에서는 낮은 생체 이율률과 낮은 약효를 나타냄.
미세주사방법 전기천공법 리 포 솜 세포투과율이 낮고, 세포막에 손상을 입히는 안전성과 안정성의 문제점을 가짐

7 단백질 전달기술 단백질, 펩티드 및 핵산을 세포내로 전달하기 위한 방법 중
최근에 가장 활발히 연구되고 있는 “단백질 치료법”의 핵심분야 단백질 전달기술 세포투과 펩티드 (CPP) 단백질 전달체 (PTD) 세포막 투과능이 우수 단백질 전달체 ( PTD : Protein Transduction Domain ) 즉, 단백질 또는 펩티드를 유전자재조합이나 화학적으로 접합시켜 세포투과 펩티드와 결합시킨 융합체를 만들어 세포내로 전달시키는 기술.

8 표 1. 단백질전달체의 구분 안테나페디아 // 페네트라틴

9 2-2 세포투과 펩티드 2-2-1 TAT 1988년에 TAT 단백질의 세포막 투과능에 대해 처음 보고.
2-2 세포투과 펩티드 TAT 1988년에 TAT 단백질의 세포막 투과능에 대해 처음 보고. 특정 단백질을 TAT 단백질에 유전자재조합 또는 화학적으로 융합시켜 형질도입에 이용한 연구가 진행됨. TAT 단백질은 2개의 엑손(exon)에 의해 암호화. 1st 엑손(exon)은 TAT 단백질이 활성을 나타내기에 충분한 N-말단을 암호화함. 세포투과 펩티드는 크게 자연적으로 발생되는 형태와 인공적으로 합성된 형태의 두 가지(2) 로 분류 할 수 있다. 가장 먼저 보고된 단백질전달체는 다양한 세포로의 침투에 효과적인 인체 면역결핍 바이러스 (HIV-1)로부터 추출된 “트랜스활성전이활성제 (TAT)”이다. ※ 엑손 : 진핵생물의 유전자 가운데 최종 단백질 산물을 만들어 내는 부분으로서 “ 아미노산을 합성 할 수 있는 부분”을 말한다. TAT 단백질 – 86개의 아미노산 서열을 가짐. 최근에 Dowdy et. al. TAT 단백질의 47~58번 아미노산 잔기와 특정 단백질을 융합시킨 “유전자재조합 융합단백질”을 개발.

10 그림 1. TAT 융합단백질 정제과정. (a) TAT 융합단백질을 제작하기 위한
박테리오파지 bacteriophage : 파지(phage) 또는 세균성 바이러스라고도 함. 즉, 세균을 감염시키는 바이러스군(群). '세균을 잡아먹는 것'이라는 뜻. 최초로 연구된 파지들은 1형(T1)부터 7형(T7)으로 명명된 것들이다. 짝수형 파지인 T2, T4, T6는 바이러스 증식 연구의 모형으로 사용되었다 그림 1. TAT 융합단백질 정제과정. (a) TAT 융합단백질을 제작하기 위한 pTAT-HA 박테리아 발현벡터. (b) 정제과정의 모식도

11 TAT 펩티드의 내재화 TAT가 PTD로서 역할을 하기 위해서는 11개의 아미노산 서열이 필요
α-나선의 형성. 48 ~ 60번 아미노산 서열이 반드시 필요. 2 49 ~ 57번 아미노산 서열 중 제외된 서열이 있으면 세포막 투과능이 감소된다고 보고됨. TAT 펩티드의 내재화 TAT가 PTD로서 역할을 하기 위해서는 11개의 아미노산 서열이 필요 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) 47 57 내재화 : 마음이나 인격 내부에 여러 가지 습관이나 생각, 타인이나 사회의 기준, 가치 등을 받아들여 자기 것으로 하는 일.

12 2-2-2 Antp (Antennapedia)
페네트라틴 PTD의 기능을 가지는 Antp의 최소단위펩티드. ‘호메오도메인’의 3rd 나선구조에 존재하는 16개의 펩티드 (43~58)로 구성. (Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys) Antp (안테나페이드) TAT 펩티드와 비슷하게 세포침투기작에 대해서는 명확히 밝혀지지 않았으며, 형질도입 중에 마이셀을 형성한다는 가능성만 제기 되었음.

13 2-2-3 HSV-1 단백질 VP22 VP22는 다른 PTDs와는 다르게 세포내 도입을 위한 작은 부분이 없음.
세포 안으로의 물질수송이나 세포골격의 붕괴유도, 유사분열기간의 핵전위 그리고 염색질 또는 핵막과의 결합 등의 역할도 하며, 이러한 기능들은 펩티드의 특정한 부위에 의해 조절됨.

14 VP22내 아미노산 서열에 따른 기능 세포 안으로의 물질수송 핵지향성 및 세포골격의 붕괴방지 결합과 세포골격의 재구조화
81~195번 결합과 세포골격의 재구조화 159~267번 핵지향성 및 세포골격의 붕괴방지 81~121번 핵지향성과 물질수송의 촉진 267~301번

15 아르기닌 잔기의 곁사슬인 “구아니디니움” 그룹은
아르기닌올리고머 아르기닌 잔기는 TAT 펩티드의 형질도입능력에서 중요한 역할을 함. 6개나 그 이상의 아미노산으로 구성된 L- 또는 D-아르기닌은 동일한 길이의 다른 펩티드보다 우수한 세포내 물질전달능력을 가짐. 6개 미만의 아미노산으로 이루어진 아르기닌 펩티드는 세포막 투과능력이 없는 것으로 보고됨. 아르기닌 잔기의 곁사슬인 “구아니디니움” 그룹은 세포내 형질도입에 중요한 역할을 함.

16 그림 2. R9의 세포내 도입경로.

17 MAP > 트랜스포탄 TAT > 페네트라틴
기타 펩티드 (1) MAP MAP는 다른 물질을 세포 안으로 수송할 수 있는 능력이 있는 것으로 보고됨. 세포유입과 물질수송면에서, MAP는 섭취가 가장 빠르고 물질수송에 효과적임. 세포막의 균형을 깨는 기능을 가지고 있으며, 그 정도는 펩티드의 소수성에 비례함. MAP > 트랜스포탄 TAT > 페네트라틴

18 (2) 신호서열 펩티드 NLS (nuclear localization signal)
펩티드의 신호서열 또는 막투과서열 (MTSs)은 적합한 세포내 소기관의 막 안으로 단백질을 이동시키는 수용체에 의해 인지됨. NLSs에 결합되어 있는 MTSs는 세포 안으로의 물질이동과 핵으로의 물질축적을 가능하게 함. NLS (nuclear localization signal) 라이신과 아르기닌이 많이 함유된 짧은 펩티드. 이 부위의 인식으로 단백질이 핵 안으로 능동적으로 이동함.

19 (3) PreS2 세포투과능력은 헤파타이티스-B 바이러스 표면항원의 Pres 2-도메인에서도 관찰.
에너지 비의존적인 방법을 통해 세포 안으로 침투해 세포질에 고르게 분포. 세포투과능은 41번과 52번 아미노산 사이에 있는 양친매성 α-나선과 관련 있고, 트렌스로케이션 모티프 (TLM)의 파손은 세포투과기능의 상실을 초래. PresS2-TLM은 그 자체만으로 단백질과 펩티드의 운송체로 이용가능함..

20 (4) PTD-4, PTD-5 양전하를 띠고 있는 PTD-4, 5 는 M13 파지로부터 12개의 펩티드 서열로
합성되었고, in vivo 와 in vitro 모두에서 우수한 세포투과능을 보여줌 . 이 두 PTD는 암과 관절염치료용 단백질약물과 DNA의 전달을 위한 잠재력이 있는 것으로 알려져 있음. In vivo : 생체조건 안에서의 In vitro : 생체조건 밖에서의

21 (5) 헵 티 드 최근 헵티드라고 알려져 있는 헵토탁틱 펩티드가 세포막을 투과하는 것이 보고됨.
헵티드의 아미노산 서열은 소수성 잔기와 양전하를 띄는 잔기를 모두 가지고 있음. 헵티드는 인간 피브리노겐 서열과 동일한 펩티드로 이루어져 있기 때문에 안전한 형질 도입제로 고려되고 있음.

22 2-3 세포투과기작 공 통 점 PTD는 구조적 다양성으로 인해 세포유입기작이 아직까지 정확히 알려져 있지 않음.
2-3 세포투과기작 PTD는 구조적 다양성으로 인해 세포유입기작이 아직까지 정확히 알려져 있지 않음. 공 통 점 염기성의 아르기닌과 라이신을 주요성분으로 함. 특히, 아르기닌의 구아니디니움 그룹은 PTD의 생물학적 활성 및 특성에 중요한 구조적 구성요소로 알려져 있음. 생체막 성분과 아르기닌의 정전기적 상호작용, 수소결합 등이 세포유입에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있음.

23 소포체 : 모든 세포 안에 존재하는 막상구조(膜狀構造)로서 세포내 망상구조라고도 한다.
※ PTD융합단백질은 HS(황산헤파란) 또는 미지의 수용체와 결합하고 엔도사이토시스 또는 마크로피노사이토시스에 의해 세포내로 전달된다. 엔도사이토시스 소포체는 리소좀과 융합되고 헤파린 분해효소에 의해 HS가 PTD 융합단백질로부터 분리되어 PTD 융합단백질이 소포체로부터 방출되거나 분해된다. 클로로퀸 처리는 리소좀으로부터 융합단백질의 방출을 돕거나 분해를 방지한다. 방출된 PTD융합단백질은 세포질에 머무르거나 핵으로 이동한다. 그림 3. PTD 융합단백질의 세포내 전달기작.

24 1 2 3 3가지 방법 - PTD의 세포내 섭취 양친매성 펩티드가 세포막에 수직방향으로 삽입되는 것.
펩티드가 세포막에 있는 지질의 극성 머리와 정전기적 상호작용으로 결합하여 순간적으로 펩티드와 운반물을 포함한 마이셀을 형성하는 것. 2 엔도사이틱 소포체로부터 세포질로 분비되는 엔도사이토시스를 통한 물질전달 방법. 3

25 2-4 생리활성 거대분자의 세포내 전달 세포투과 펩티드는 다양한 거대분자를 in vivo 와 in vitro 상에서 포유동물의
2-4 생리활성 거대분자의 세포내 전달 세포투과 펩티드는 다양한 거대분자를 in vivo 와 in vitro 상에서 포유동물의 세포내로 수송하는데 매우 효과적임이 입증되었다. 단백질, 약물, 핵산 또는 다른 거대분자를 PTD에 결합시키는 것은 기존의 방법보다 우수하며 다양한 세포에 적용되고 있다.

26 2-4-1 단 백 질 TAT 펩티드는 이종 단백질의 세포내 전달을 가능하게 함.
단 백 질 TAT 펩티드는 이종 단백질의 세포내 전달을 가능하게 함. 융합단백질의 합성을 위한 TAT 펩티드와 표적분자 사이의 결합은 박테리아 발현벡터를 통해 이루어짐. 변 성 가 용 화 정 제 TAT를 이용한 단백질 전달은 치료제와 예방백신으로의 활용이 가능함. TAT은 췌장소도 세포이식에도 응용됨. TAT 융합단백질은 산화적 스트레스를 포함한 질병치료에도 잠재적인 치료효과가 있음.

27 2-4-2 핵 산 TAT 그리고 Antp 펩티드와 핵산의 접합은 핵산의 세포내 전달을 향상 시킴.
핵 산 TAT 그리고 Antp 펩티드와 핵산의 접합은 핵산의 세포내 전달을 향상 시킴. TAT 펩티드는 플라스미드 DNA를 응축하고 핵산분해효소의 분해로부터 DNA를 안정화 시키며, 또한, TAT의 NLS 작용으로 핵으로의 유전자전달이 향상됨. TAT 펩티드는 DNA와 정전기적 상호작용으로 복합체를 형성하며 엔도사이토시스를 통해 새포내로 전달됨. VP22는 in vivo 와 in vitro 에서 핵산의 전달에 이용됨.

28 항 체 항체는 그들의 종양세포 사멸효과 때문에 세포 안으로 전달될 필요가 있음 그러나 면역글로블린은 스스로 원형질막을 통과할 수 없으므로 전기천공법이나 미세주사법 등이 항체의 전달을 위해 이용되었으나, 세포막의 붕괴나 세포생존율의 저하로 인한 문제점이 있었음. 세포투과 펩티드를 이용한 항체 전달시스템이 연구되기 시작 항체를 전달시키기 위한 또다른 방법 TAT 융합단백질의 이용

29 2-4-4 나 노 입 자 세포투과 펩티드를 이용한 나노입자의 새포내 전달은
나 노 입 자 세포투과 펩티드를 이용한 나노입자의 새포내 전달은 생체에 적합한 텍스트란이 도포된 슈퍼파라마그네틱 산화철(SPIO) 나노입자와 TAT 펩티드를 접합시켜 림프구로 침투시킬 경우 침투율이 TAT 펩티드를 이용하지 않은 나노입자보다 100배 이상 증가하는 것을 확인 할 수 있음. TAT 펩티드와 자성을 띤 나노입자를 결합시켜 조혈세포와 신경전구세포를 가시화하기 위해 표지하고, 표지화된 세포들은 in vivo 로 옮겨진 후 자성을 이용한 분리와 정제가 가능하며, 특정한 줄기세포와 기관의 상호작용분석에 이용됨.

30 2-4-5 기타 분자 (1) 특수펩티드 TAT 펩티드와 VP22가 디프테리아 톡신 A(dtA)절편과 융합되었을 때,
기타 분자 (1) 특수펩티드 TAT 펩티드와 VP22가 디프테리아 톡신 A(dtA)절편과 융합되었을 때, dtA를 세포표면에 결합하기 쉬운 헤파린 결합단백질로 전환시킴. 활성을 띠고 있는 dtA의 세포내 전달은 제한적이지만 TAT-dtA 융합체는 결합력과 홀로톡신에 대응하는 독성을 증가시킴.

31 (2) 조 영 제 조영제의 세포내 전달은 세포막의 지질이중층을 통과하지 못하기 때문에 이용하기가 어렵다.
옥소테크로티움과 옥소레니움의 TAT 펩티드와 복합체는 세포막을 빠르게 통과할 수 있으며, 세포질과 세포내 소기관으로 축적을 증가시킴.

32 이 시스템은 DNA 백신이나 in vivo 에서의 유전자치료에 다양하게 응용될 수 있음.
(3) 리 포 솜 PTD를 이용한 마이셀과 리포솜 같은 약물전달시스템의 세포내 전달은 중요함. 200nm 크기의 PEGylation된 리포솜의 표면에 TAT 펩티드를 부착시켜 다양한 세포에 전달하는 연구가 됨. TAT-리포솜의 세포내 전달은 리포솜의 TAT와 세포표면의 직접적인 상호작용이 중요하게 작용함. TAT-리포솜은 DNA와 복합체를 구성해 ‘TAT-리포솜-DNA’ 구조를 형성할 수 있는데, 이 복합체는 일반적으로 사용하는 유전자전달시스템보다 작은 독성을 나타내면서 정상세포와 암세포 모두에 유전자를 전달하는데 유용함. PEGylation is the process of covalent attachment of poly(ethylene glycol) polymer chains to another molecule PEGylation : 다른 분자에 “폴리에틸렌글라이콜”을 공유결합 하는 공정을 말한다. 이 시스템은 DNA 백신이나 in vivo 에서의 유전자치료에 다양하게 응용될 수 있음.

33 2-5 결 론 PTDs의 효과적이고 독성없는 세포막 투과능은 펩티드, 단백질 그리고 핵산의 새포내 전달을 위한 새로운 길을 열었으며, PTD를 이용한 물질전달기술은 기초적인 연구 및 질병치료의 응용을 위한 획기적인 방법으로 주목 받고 있음. 다양한 PTDs는 거대분자약물과 나노입자의 새포내 전달을 가능하게 하였으며, 약물전달시스템의 개발, 백신개발, 그리고 분자영상 등의 연구에 활발하게 응용되고 있음. 표적세포와 기관에 따라 최적의 PTD를 디자인하기 위해서는 세포막 투과기작과 면역원성, 세포내에서의 역할과 같은 몇 가지 문제에 대해 심도 깊은 연구가 진행되어야 함.