2. 세포 내막계 세포의 구획 필요성 세포에는 상존 불가능한 수많은 화학반응이 동시에 수행되고 있다.

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1 2. 세포 내막계 세포의 구획 필요성 세포에는 상존 불가능한 수많은 화학반응이 동시에 수행되고 있다.
특정 회로 관련 효소들  거대 단백질 복합체 구성 (원핵, 진핵 공통) 막 구조물로 구획  막성 세포소기관 분화 (진핵세포) 핵양체 1. 막성 세포소기관: 진핵세포의 막성 소기관과 진화 2. 단백질 분류 : 3가지 이동 기작, 신호서열, 핵 단백질, 미토콘드리아와 엽록체 단백질, 소포체 단백질과 막관통 단백질, 등의 합성과 이동 3. 소낭 수송 : 수송 소낭과 출아, SNARE에 의한 소낭 결합 특이성 4. 분비 경로 : 소포체와 골지체의 단백질 수식, 분비의 조절, 외포작용. 5. 내포작용 경로 : 식작용, 음작용, 내포작용, 리소좀과 세포내 소화

2 1. 막성 세포소기관 세포기관의 진화: 2 가지 진화 경로
최초의 진핵세포 전구체: 내막 구조가 없는 무기호흡성 원핵세포  원핵세포의 세포막: 전자전달, ATP합성, 지질 합성 등 기능 수행 - 진핵세포는 세균에 비해 1, ,000  부피, 낮은 표면적 비. 확산에 의한 물질 수송의 한계: 내막계의 필요성  단계적 진화: 내막계의 형성, 세포내 공생 (1) 세포막의 함입에 의한 내막계 (endomembrane system) 형성 - 원시 원핵세포의 세포막이 막 결합 DNA와 함께 함입  DNA를 싸는 이중막 형성  핵 핵, 소포체, 골지체, 리소좀, 식포, 내포, 외분비낭 등 내막계 형성 핵의 외막은 리보솜 결합 RER에서 형성 세포 안팎 및 이들 소기관 간에는 소낭 수송에 의해 활발한 물질교환 소기관의 내막 층과 세포막 외 층의 유사성 현존 광합성세균에도 세포막 함입 현상이 있음.

3 (2) 미토콘드리아와 엽록체의 진화: 세포내 공생설
- 이들 소기관은 독자적인 DNA를 가지며, 구성 단백질 일부 합성 리보솜의 크기, 유전체의 모양, 내막의 전자전달 기능이 세균과 유사 이중막을 가지며, 소낭 수송에서 제외 - 원시 혐기성 세균이 호기성세균 및 광합성세균과 단계적 세포내 공생 호기성 세균: 미토콘드리아의 기원  광합성 세균: 엽록체의 기원

4 2. 단백질 분류 진핵세포 분열에서 막성 소기관의 분배 세포의 단백질 합성 : 2가지 경로 세포 소기관 단백질 이동 기작
막성 소기관은 기존의 소기관에서 유래, 간기 중 성장, 핵 분열 후 세포질 분열에서 두 딸세포로 배분 세포분열과정 중 핵막, 소포체, 골지체는 소낭으로 딸세포에 나누어 들어간 다음 융합 재생 소기관의 성장에서 단백질은 어디서 합성되어 어떻게 해당 소기관까지 정확히 이동하는가? 세포의 단백질 합성 : 2가지 경로 세포 소기관 단백질 이동 기작 (1) 핵: 핵공을 통한 능동수송 (2) 소포체, 미토콘드리아, 엽록체, 퍼옥시솜 : 단백질 전좌체 (3) 골지체, 리소좀, 외분비낭, 외포작용: 수송 소낭

5 신호가설 : 아미노산 신호 서열에 의한 세포내 구획간 단백질 운반
외분비 단백질의 합성경로: George Palade, 1974 : H3-Leu, Pulse label, Cold chase Autoradiography 17 min 100 min 신호가설 (Signal Hypotheis) : Günter Blobel & Bernhard Dobberstein, 1999 NPW, JCB 67: ,1975 골수종 (myeloma) 환자의 면역글로뷸린(IgG) 가벼운 사슬: mRNA의 암호 서열에 비하여 분비된 가벼운 사슬 N-말단 20여개 아미노산이 없어진 점에 의문 가설: N-말단의 이 특이 서열이 신호서열로 번역중인 리보솜이 소포체 막에 결합하게 한다. 합성 단백질은 소포체 내강, 골지체, 외분비 낭 등을 거쳐 분비됨을 규명 외분비 단백질은 아미노산 서열에 내장된 분류신호 (sorting signal)에 따라 이동한다는 신호가설을 제안.

6 : KDEL ER 분류신호: 15-60개의 아미노산 서열로 구성, *유전자 재조합 실험으로 입증
 세포기질 단백질에 ER 신호서열 추가  ER로 이동 동일 소기관 단백질들간에 신호 서열의 다양성 아미노산 서열의 보존성보다, 전하성, 친수성, 극성 아미노산의 위치, 등 물리적 성질이 더 중요함을 시사 : 8개 정도 소수성 아미노산 : 양전하성 아미노산 서열 : 연속 양전하성 아미노산 서열 (KKKRK) : KDEL

7 (1) 핵공을 통한 핵 단백질의 이동 핵막 내막: 핵 기저층은 필라멘트성 염기성 단백질인 라민이 망상 구조를 이루어 핵막 지지 및 염색사와 결합 - 외막: ER과 연속, 구조적으로 유사. 핵공: 핵 단백질, RNA, ribosome 소단위체 등의 이동통로 핵공 복합체: 100여 개 단백질로 구성, RNA, 단백질 같은 거대분자는 적절한 분류신호 없이는 통과 불능 작은 수용성 분자가 이동할 수 있도록 물로 채워진 통로 포함 핵 단백질의 핵 위치신호 (nuclear localization signal): 짧은 연속 양전하성 아미노산 신호서열(-KKKRK-)  세포질의 핵 수송수용체가 핵단백질의 핵 위치신호 에 결합  <수용체-핵단백질 복합체>는 핵공 원섬유에 의해 핵공으로 유도 핵단백질이 핵공에 결합하면 핵공이 열리고,  수용체에 결합된 핵 단백질은 GTP 가수분해로 능동수송. 통과 후 수용체는 분리되어 세포기질로 이동.  단백질의 3차 구조가 유지된 채, 리보솜은 조립 완성된 상태로 이동

8 (2) 미토콘드리아와 엽록체 단백질의 이동 신호서열 (양전하성 아미노산 서열), 샤페론 단백질 (HSP70, HSP60)과 막 전위의 협조  NH2-말단의 신호서열을 통하여 외막의 수용체에 결합-단백질 복합체 형성 내, 외막이 만나는 특수부위로 측면 확산 3차 구조가 풀리면서 단백질 전좌체(translocator)에 의해 두 막을 가로질러 수송. 이 때 chaperone 단백질은 수송을 돕고, 수송이 끝난 단백질의 3차 구조 재형성에 관여 신호서열은 수송 후 signal peptidase에 의해 절단 안으로 들어간 다음 내, 외막 등 특정 부위로 수송되는 단백질에는 제2의 분류신호가 있으며, 이는 첫번째 신호서열이 제거된 후 노출 * 막 지질은 ER에서 합성된 후 지질 운반단백질에 의해 소기관에 운반.

9 (3) 타 소기관 단백질은 소포체에서 합성 수용성 단백질은 소포체 내부로 방출
세포막, 소포체, 골지체, 외분비낭, 리소좀으로 이동할 단백질 - ER 신호서열: 8개 정도의 소수성 아미노산 영역 수용성 단백질은 소포체 내부로 방출  N-말단 70여개 aa 중합하면 폴리펩티드가 리보솜 밖으로 신장되어 나옴  세포기질의 신호인지 입자 (signal recognition particle, SRP)가 폴리펩티드의 ER 신호서열에 결합  단백질 합성 중단 또는 속도 지연 <SRP-ER 신호서열 복합체>  ER의 SRP receptor에 결합  SRP는 ER막에서 분리, 단백질 합성 재개  폴리펩티드 사슬이 ER막의 translocation channel을 통해 내강으로 이동 해독이 끝나면 신호서열이 signal peptidase에 의해서 절단되면서 내강으로 방출 (ER 내강 단백질, 외분비 단백질, 골지체 및 리소솜 내강 단백질, 등)

10 막관통 단백질은 소포체 막에 삽입 제2의 신호서열: 막 삽입 개시와 이동 종결 서열
(~ 20 소수성 aa, + 양전하성 aa as anchor) 막관통 단백질의 전좌과정  NH2-말단의 소수성 ER 신호서열에 의한 전좌  이동 종결 서열 (stop-transfer sequence)에 이르면 전좌채널을 빠져 나와 막에 고정  NH2-말단 신호서열 절단: NH2-말단은 소포체 내강을, COOH-말단은 세포 기질을 향함  막관통 단백질로 존재 막관통 단백질의 ER 신호서열이 단백질 내부에 존재 할 경우 ER 신호서열은 이동 개시 서열로 작용하지만 signal peptidase의 작용을 받지 않음 이동 종결 서열이 전좌 채널에 들어갈 때, 이 두 신호서열이 인지질 막으로 밀려나 2개의 -나선 막 관통영역이 됨 -나선이 여러 번 막을 관통하는 경우  이동 개시 서열과 종결서열이 여러 개 필요, 계속적인 시작과 종결로 여러 번 막을 관통

11 소포체에서 단백질의 공유결합에 의한 변형 단백질은 정확한 folding, 복합체 형성 여부를 확인, 이동, 그렇지 못한 것은 분해 Disulfide bond 형성 이동 중 pH변화나 분해에 대비, 단백질 구조 안정화 단백질 당화(glycosylation)  당 단백질 ER에서 단백질의 바른 folding 및 안정화 단백질 분류의 수송 신호로 작용 세포막 단백질은 glycocalyx를 구성  세포간 인지 표식 당화 과정  소포체 막의 특이 지질인 dolichol phosphate에 <14-oligo당: core CHO> 합성. 단백질의 전좌과정에서 특정 Asn (-Asn-X-Ser/Thr-)이 ER내강으로 들어오면 ER내막의 올리고당 전이효소에 의해서 올리고당이 Asn 측쇄에 결합  N-결합 배당체 형성

12 3. 소낭 수송 (Vesiclular Transport)
ER에서 합성된 외분비 및 타 소기관 단백질은 수송 소낭 (transport vesicle)의 출아와 융합에 의해서 GA를 거쳐서 수송됨 수송 소낭은 막 구획간 단백질과 막을 운반 소낭 수송은 외분비 경로, 내포작용 경로 모두에서 이루어지며, 내포작용 경로에서 먼저 규명되었다.

13 단백질 외피 조립에 의한 소낭 출아 Clathrin : 출아하는 소낭 표면의 피복단백질
cargo receptor에 결합한 adaptin에 결합하며, 막의 구조변화 야기, 소낭 출아 유도 피복구(coated pit)  피복소낭(coated vesicle) 형성 분비 경로: ER에서 출아  GA  lysosome/외분비낭 내포작용: PM에서 출아  내포 (endosome) COP: coat protein 내포작용에서 피복소낭 (coated vesicle) 형성 과정 수용체(R)와 운반분자(Ligand) 결합  측면이동  수용체에 adaptin 결합  clathrin 결합 GTP결합 단백질인 dynamin이 피복구의 목부위에 고리 모양 조립  GTP 가수분해  dynamin 수축  피복소낭  피복분리  수송소낭

14 소낭 결합특이성 결정: SNAREs 각 수송 소낭 막에는 특이 지표 단백질인 v-SNARE,
표적막에는 상보적인 수용체 단백질인 t-SNARE SNARE : SNAP Receptor SNAP : soluble NSF attachment protein NSF : NEM(N-ethylmaleimide) sensitive fusion protein  SNARE : NEM민감성 융합단백질의 부착단백질 수용체  SNARE에 의한 융합 기작 수송 소낭과 표적막의 SNARE간 인식 및 결합  특정신호 전달 두 막이 1.5 nm이내로 근접  융합 단백질의 결합으로 융합복합체를 형성 융합과 내용물 전달

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16 4. 분비 경로 (Secretory Pathway)
외포작용 (Exocytosis) 단백질, CHO, 지질분자가 ER에서 PM밖으로 분비되는 경로 (secretory pathway) 이 과정 중 각 분자에 화학적 변형이 일어나면서 막성 소기관을 순서대로 통과 소포체에서 단백질의 질 관리  ER 상주 단백질: COOH- 말단에 4개 aa의 ER 잔류신호 (ER retention signal: KDEL) 이 신호가 ER, GA의 수용체에 인식되어 ER에 남게 됨.  대부분 단백질은 수송 소낭에 의해 GA로 이동.  적절히 folding되지 못하거나, 이중체, 다중체 형태를 이루지 못하면  Chaperone 단백질과 결합, 적절히 folding될 때까지 이동억제, 또는 분해 예: 항체: 4 polypeptides로 구성 예: 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) : 유전적 변이에 의해 특정 PM 수송단백질의 folding 이상으로, 단백질이 ER 내에 축적  기능적으로 불완전한 세포형성

17 골지체에서 단백질의 변형과 분류 GA: 세포중심(핵, 중심체)에 위치, 다중 엽(cisternae) 구조
cis-cisternae (유입되는 면, ER 쪽), medial cisternae, trans-cisternae (배출면, PM 쪽) 단백질은 ER 유래 수송 소낭을 통해  cis-GA로 유입된 다음 cisternae간 소낭 수송 trans-cisternae에서 수송 소낭에 의해  PM, 또는 다른 소기관으로 이동  Cisternae를 거치면서 배당체 수식(올리고 당의 부분 분해, 단당 첨가) 및 인산화 단백질의 Ser/Thr에 O-결합 배당체 형성 단백질의 소낭 분류는 trans-GA에서  acidic pH, 고농도 칼슘 등의 특수 환경으로 200x 고농도로 응집, 농축 포장  특정 자극에 따라 많은 단백질을 신속히 분비할 수 있도록 함 골지체 특이 형광 항체 염색

18 외포작용에 의한 분비 상시 외포작용 (constitutive exocytosis):
소낭이 수시로 trans-GA에서 돌출, PM에 융합, 단백질과 지질을 PM 막에 공급 또는 분비 조절 외포작용 (regulated exocytosis): 분비를 위해 특수화된 세포에서만 작동 호르몬, 점액, 소화효소 등 특정 생산물 합성  분비소낭 (secretory vesicle) 저장  외부자극이 있을 경우 신호전달로 PM과 융합, 배출 예: -cell의 혈당량 증가에 따른 insulin 분비

19 5. 내포작용 경로 (Endocytic Pathway )
식세포에 의한 거대 입자 섭취 원생동물의 식세포 작용: 세균 등 거대입자 포획, phagosome형성  lysosome 융합  소화 식세포 (Phagocytic cells):  대식세포 (macrophage) 등; 감염 미생물 섭취, 소화로 감염에 대한 일차 방어작용  항체가 결합된 세균입자가 식세포 표면 수용체에 결합  위족(pseudopod)을 내어 포식  PM의 융합에 의해 식포 형성  죽은 세포, 손상된 세포, 세포단편을 청소: 대식세포는 매일 수명을 다한 RBC 1011개(천억) 이상 섭취 음작용(Pinocytosis) : 액체와 거대 분자 진핵세포는 음세포 소낭(pinocytic vesicle) 형태로 액체를 끊임없이 섭취 : 선별 특성 미약  macrophage  매시간 자신의 부피의 25% 에 해당하는 액체 섭취 = 분당 원형질막의 3%, 30분에 전체 100%를 섭취.  Fibroblast  낮은 비율  Amoeba  빠른 속도로 원형질막 섭취

20 특정 분자를 위한 수용체 매개 내포작용 (Receptor mediated endocytosis)
 거대분자를 선택적으로 세포 외액에서 섭취 거대분자는 세포표면의 수용체에 결합, 수용체-거대분자 복합체 형성 clathrin-coated vesicle을 이루어 세포내로 들어옴  특정 거대분자를 1000X 효율로 세포 내로 유입 ① 콜레스테롤의 수용체에 의한 내포작용: Brown and Goldstein, 1986 NPW 콜레스테롤은 혈장의 특정단백질과 결합  저밀도 지방단백질 (low density lipoprotein, LDL) 입자 LDL이 receptor에 결합  receptor-LDL 복합체  수용체 매개 내포작용  피복소낭  내포 내포막의 H+-펌프 작동, 내부 산성화  수용체로부터 LDL 분리  수용체는 transport vesicle을 통해 PM으로 재순환  LDL은 리소솜으로 이동, 가수분해효소에 의해 분해  유리된 콜레스테롤은 세포기질로 방출, 새로운 막 형성에 사용됨 결함이 있는 경우: 선천성 고혈압  수용체 결함  타 내포작용 관련 요소의 작동 부진 콜레스테롤 혈액 축적  동맥경화 ② Vitamin B12, 철분, 난황, 신호전달 물질, 독감 바이러스 등

21 내포 (endosomes)에서 거대 분자의 분류
 수용체와 수용체에 결합된 물질의 분리 수용체는 PM으로 복귀, 일부 수용체는 세포기질로 이동, 분해 다른 부류의 수용체는 반대쪽 PM에 전달; 한쪽 세포외 공간의 물질이 반대쪽 공간으로 이동 세포통과 (transcytosis) 수용체에 결합한 분자는 수용체와 분리된 후, 리소솜으로 이동, 분해됨

22 리소좀과 세포내 소화 . - 리소좀: 40여종의 가수분해효소 보유, 최적 pH~5
ATP-dependant H+ 펌프로 산성유지 세포기질(pH7.2), 세포 밖(pH7.4)으로 방출되더라도 최적 pH 범위 이탈로 손상 최소화 이 효소 단백질은 ER  cis-GA에서  mannose-6-phosphate로 표지  trans-GA에 도달  <M-6-P>수용체 인식  수송 소낭에 의해 리소좀에 운반 . 세포내 소화  식포  lysosome 융합  endosome  리소좀과 융합. 세포 자신의 노화부분: 자가포식(autophage)  자가포식소낭 (autophagosome) 형성  리소좀 융합