18. Real-time PCR을 이용한 HBV DNA의 정량

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1 18. Real-time PCR을 이용한 HBV DNA의 정량
4조 김기경 이규리

2 Real-time PCR이란? 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링 하여 해석하는 기술
ethidium bromide(Etbr)을 첨가하여, 이중나선 DNA의 양이 증가할 마다 형광 발광량이 증가하는 것을 CCD 카메라로 실시간 모니터하여 PCR 증폭곡선을 측정 * PCR : DNA의 염기서열 중 원하는 부분을 선택적으로 복제 중복시키는 기술

3 (1)DNA-binding dye를 이용한 real-time PCR
결합되는 염료의 형광 발산량이 증가 실시간 검출

4 (2) 형광표지 프로브를 이용한 real-time PCR
TaqMan 프로브 5’-끝 : 형광보고자 결합, 3’-끝 : 형광흡수자 결합 exonuclease 활성 형광발산

5 (2) 형광표지 프로브를 이용한 real-time PCR
양 말단을 형광보고자, 형광흡수자를 결합시켜 헤어핀 구조로 제작하여 사용

6 Taqman HBV test 검체 DNA와 표준물질 DNA를 동시에 PCR하면서 실시간으로 측정되는 표준 DNA의 형광량을 이용하여 표준곡선을 구하고, 측정된 검체의 Ct 값을 보정하여 표준곡선에 대입함으로 HBV DNA를 정량

7 HVB DNA 정량검사 HBV DNA 정량검사: 결과 판독에 있어 신중한 검토가 필요한 검사 검사에 영향을 미치는 오류
1)형광물질의 관리(빛을 차단) 2)PCR시험관으로 사용되는 K-tube

8 Real-time PCR의 적용 대립인자 특이성 프로브를 이용한 SNP 분석
각 프로브는 TaqMan 프로브나 molecular beacons 프로브 방식으로 제작하여 사용

9 두 가지 프로브는 각각 두개의 대립인자, 혹은 두 가지 SNP에 특이적으로 결합 →PCR 중에 각 형광이 서로 다른 파장에서 측정됨 각 프로브는 SNP 위치의 단 하나의 염기 차이에 의하여 주형 DNA와 결합여부 결정

10 각 대립인자의 존재에 따라 PCR 순환반응 중에 증가하는 형광이 달라지게 된다.

11 ※ 두 형광 물질의 RFU가 한 화면에서 구별되어 이형접합자인지
두가지 형광중 한쪽만 증가할때 : 동형접합 대립인자 두가지 형광이 동시에 증가 : 이형접합 대립인자 ※ 두 형광 물질의 RFU가 한 화면에서 구별되어 이형접합자인지 동형접합자인지를 쉽게 알 수 있음

12 2) ΔΔCT 을 이용한 상대적 정량 PCR 골수이식 성공 - 혈액검체에서 수용자의 대립인자 검출 X
대조 DNA와 환자의 대립인자의 CT의 차이 ΔCT - ΔCT는 골수 수용자의 세포가 골수이식 후에 얼마나 존재하느냐에 따라 비례적으로 관찰됨 골수이식 전 검체의ΔCT와 이식 이후 검체의 ΔCT의 차이 ΔΔCT - ΔΔCT값이 클 수록 골수 이식 이후 골수 수용자의 세포가 적게 남아 있다는것을 의미 ΔΔCT 방법은 유전자의 상대적 발현정도를 측정하는 데에 유용

13 감사합니다