Comet Assay(single cell gel electrophoresis assay)

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1 Comet Assay(single cell gel electrophoresis assay)

2 Background Comet Assay는 세포내 DNA의 damage를 평가하는 단세포 전기영동법(single cell gel electrophoresis assay)이다. 변성되고 잘려진 DNA 단편들이 damage를 입지않은 DNA에 비해 전하(current)에 의해 세포 밖으로 이동하는 속도가 빠른것을 이용한 실험법.

3 Applications DNA damage에 대한 세포 반응 연구
DNA repair (cancer therapy)에 대한 inhibitor의 스크리닝 독성 테스트에서의 화학물질 연구

4 Assay Overview

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6 Comet Definitions Percent DNA in the Tail
The integrated tail intensity x 100 divided by the total integrated cell intensity for a normalized measure of the percent of total cell DNA found in the tail

7 Comet Definitions Tail Moment
- The product of distance and normalized intensity integrated over the tail length, Σ (L (Lx • % DNA DNAx) - a damage measure combining the amount of DNA in the tail with the distance of migration (severity of damage)

8 Alkaline Electrophoresis Conditions
표준 방법 - Singh et al. 1988 - Olive and Banath, 2006 - Fresh Alkaline Buffer and large horizontal tank - Cold 1 mM EDTA and 300 mM NaOH, pH>13 - Add buffer so barely covering slides - Electrophoresis for 20 Electrophoresis for min(0.7 V/cm or 1 V/cm at 300 mA)

9 Electrophoresis

10 Control Cells Control Cell은 실험자간 또는 실험실간 전기영동 과정을 표준화하고 비교하는데 사용된다.
4개의 동일하지 않은 부유 세포로서 단계적으로 DNA damage를 증가시켰다. 알카라인 전기영동에 사용 장기간 사용가능

11 Control Cells: % DNA in Tail

12 Control Cells: % DNA in Tail