천연소재의 이용 식물  동물  해조류  기타 의약품 기타 천연소재 화장품 식품.

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1 천연소재의 이용 식물  동물  해조류  기타 의약품 기타 천연소재 화장품 식품

2 Standardized Extracts
천연물소재 연구개발의 경제성과 성장 가치 가격상승 천연약물(품) Natural Drugs Dietary Supplements 건강보조식품/첨가물 규격 추출물 Standardized Extracts 부 가 가 치 향 상 Extracts / Tincture 추출물/팅크제 Standardized Herbs 규격약초 생약(生藥)에 알코올 또는 묽은 알코올을 가하여 유효성분을 침출한 액체. 건약초 Dried Herbs Fresh Herbs 생약초

3 이러한 이유로 생리활성을 지니는 천연물을 분리하며, 다음과 같은 몇가지 장점이 있다.
천연소재를 이용하여 천연물 (생리활성물질)을 분리해야 하는 이유 본초의약품과 기타 천연물 기원 의약품의 사용역사는 오랜 옛날부터이지만 치료 또는 실험적 근거에서 전초를 이용하거나 조추출물을 이용하는 것은 다음과 같은 몇 가지 결점을 가진다. 지리학적으로 계절적으로 기후와 생태학적으로 또 여러 가지 식물 부위와 형태에 따라서 활성 성분의 함량에 차이가 있기 때문이다. 상승 또는 길항 작용을 가지는 불필요한 화합물들이 공존할 수 있으며 생리활성에 영향을 줄 수 있는 예기치 못한 상승 또는 길항 작용을 가지는 화합물의 공존여부 채집, 저장 및 조추출물을 얻는 과정의 다양성 때문에 생리활성이 감소될 수 있다. 이러한 이유로 생리활성을 지니는 천연물을 분리하며, 다음과 같은 몇가지 장점이 있다. 순수한 생리활성 물질들은 치료 또는 실험적 관점에서 재현성있게 정확한 용량으로서 투여할 수 있다. 특정화합물의 분석법을 확립할 수 있다. 인간이나 동물에게 이용될 때 식품의 잠재 독성과 우 수성에 대한 식물들의 검색에 이용된다. 생리활성 물질의 구조를 결정함으로서 합성물질을 대량 생산할 수 있다. 또한 구조 변경을 통 하여 구조-활성 상관관계를 확립할 수 있으며 작용 양식을 밝힌다. 따라서 더 이상 생리활성 물질원으로서 식물재료에 의존할 필요가 없다.

4 천연소재의 일반 분석 1차 대사 산물 인조산물 2차 대사 산물 전처리 단계 채집 추출 분리 추출 액체분배법 (상분리)
Stass Otto법 납염 침전법 배양액성분의 분리 Chromatography 단백질 (아미노산) 지방 (지방산) 탄수화물 (당) 무기질 비타민 추출, 분리, 정제 과정시 화합물에 화학적 변화가 일어나서 생성되는 천연물 Ex) 가수분해, Transesterification, Adduct, 인조 합성물

5 (1) 재료의 선택 : 같은 재료라도 어떤 부위냐, 어떤 상태냐에 따라 전혀 다른 방법으로 연구해야 할 때가 있다.
천연물에 대한 화학적 연구 방법 (1) 재료의 선택 : 같은 재료라도 어떤 부위냐, 어떤 상태냐에 따라 전혀 다른 방법으로 연구해야 할 때가 있다. (2) 추출 : 재료로부터 원하는 성분을 녹여서 뽑아내는 과정 관능기=작용기 : 공통된 화학적 특징을 가진 유기물들이 있을 때 그 공통적 특징의 원인이 되는 원자단(의 결합) (3) 분획 : 공통적인 특징에 따라 크게 구분하는 단계 (4) 분리과정의 추적 : 분획된 물질들을 chromatography 등의 방법을 이용하여 더 세밀하게 분리 Rf값 : 매질 상에서 용매가 이동한 거리와 시료가 이동한 거리의 비 (5) 분리 정제 : 한 종류의 화합물만 순수분리하는 단계 담체 : 혼합물 분리에 이용되는 매질(일종의 저항)

6 Preparation of materials
채 집 생태, 활성에 관한 사전 지식 재료의 정확한 감정 : 학명 타 시료의 혼입 주의 표본의 보관 처리 (Dryness, grind, cutting) 건조 : 시료의 안정성, 추출용매 선택에 영향, 추출효율, 추출, 농축 시 용이성 추출용매, 추출조건 결정 : 화합물의 안정성

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10 전통적 추출법 (Extraction) Petroleum ether : 지방, 납, 정유, 수지, sterol류, essential oil, chlorophyll, 배당체, 일부 alkaloid류 Ether 또는 CHCl3 : alkaloid류, 배당체, 색소, tannin, essential oil, 수지 등 Alcohol로 온침 : 대부분의 비극성물질, 유기산, 염, 당, saponin 등 냉수로 진출 : alcohol추출물과 유사, inulin, 수용성유기염 등 열탕으로 추출 : 전분, 점액, xylan, pectin 등 10% 염산 : alkaloid류, 물에 잘 녹지 않는 염기성 물질 5% NaOH로 온침: 단백질, hemicellulose, pectosan 등 묽은 유황으로 온침 : oxycellulose 잔유물 : cellulose, lignin 등

11 특정성분 침출법 추출종말점의 결정 적당한 용매로 재료를 침출 직접 분리하고자 하는 화합물을 함유하는 추출물을 조제
측정의 용액으로 추출한 추출물에는 반드시 다량의 성분을 함유할 수 있으므로 다시 분리를 한다. 추출 전 또는 후에 탈지, 탈색, 탈tannin, 탈단백, 발효에 의한 당의 소거 등의 처리를 행한다. 추출종말점의 결정 추출액의 일부를 증발시켜도 잔유물이 없거나 시약에 대한 반응이 나타나지 않거나 색으로 판단한다. 소량의 용매로 여러 번 추출하는 것이 효율이 좋다.

12 Alcohol에 의한 추출 (MeOH, EtOH)
식물의 부위와 수분 함량, 목적 물질을 따라 결정 비극성물질과 극성물질을 함께 함유 연구초기 특정 계통의 물질을 결정하지 않을 경우 (bioactivity guided fractionation) 용해능이 크고 경제적이며, 추출, 농축조작이 쉽다 신선한 식물 재료를 추출할 때 일반적으로 우선 효소에 의해 식물 성분이 산화 또는 가수분해되는 것을 방지하기 위하여 식물 조직을 파괴할 필요가 있다. 꽃과 잎의 경우 여러번 온침 해야 하는데 횟수는 식물에서 알코올로 용출하여 나오는 색 (잎에 있어서는 chlorophyll)의 농도로 결정한다

13 추출액의 처리 여과, 원심분리, 침전방치 후 여과, 증발농축, 침전형성, 동결건조, 감압농축 등을 행한다
가능한 저온에서 감압하여 용매를 제거 (in vacuo) : rotary evaporator 이용 Alcohol류, 물을 함유하는 용매, 신선한 시료, 반건조 시료 : 거품이 많이 형성 Monoterpene 등 저비점물질, 승화성물질 : 농축시 휘산하기 때문에 물질에 성질에 따른 농축법이 요구

14 분획 (partition) Extract (추출물) 내에 존재하는 다양한 물질을 분리
유사 극성 (polarity)을 가지는 화합물 군으로 분획 비극성으로부터 극성 순서 지용성이 높은 화합물, 수용성이 높은 화합물 서로 섞이지 않는 두 용매 (immiscible)를 사용 어떤 물질을 한 상 (phase)에서 다른 상으로 옮기는 것이며 가장 보편적인 경우는 수용액에서 유기용매로의 추출이다. 용액 속에 고체가 현탁되어 있는 경우 여과하여 분리한다 용액에 대하여 녹는 물질과 녹지 않는 물질로 나눈다 물에 녹는 물질은 용매의 극성에 따라 분배한다

15 분리과정 중 유의해야 할 사항 각 성분들의 구조를 빠른 시간 내에 결정할 수 있도록 아주 순수하게 분리하여야 한다.
성분들의 함량을 정성적으로 파악할 수 있는 예비지식 제공하여야 한다 분리과정 중에서 원래의 성분변화의 최소화  각 성분의 안정성을 고려한 분리방법 선택 열에 불안정한 시료는 감압 하에 처리 chromatography과정 중에 상호화학반응으로 분해될 수 있으므로 자주 TLC 확인하여야 한다. 원래의 화합물로 쉽게 변화시킬 수 없다면 유도체로서 분리하지 않는 것이 바람직하다

16 예지실험 Alkaloid extract 0.5g 을 10% HCl 20-30ml에 용해 → 40-50ml ether로 수층분리
→ 10% NH4OH처리 → CHCl ml첨가 후 CHCl3층을 취해 증발 농축 → 10% HCl에 용해 → Mayer시약에 의한 백탁 or 백색침전 생성여부 관찰

17 Phenol성 물질, flavonoid 당 extract 0.1g 을 물 or MeOH 5ml에 용해
→ 10% NaOH 1ml 첨가 후 황색 or 적색 정색 여부 관찰 당 extract 0.1g 을 물 2ml에 용해 → 5ml fehling reagent 첨가 후 적색 침전 생성 여부 관찰

18 Phenol 성 물질, flavonoid, tannin
배당체, 탄수화물(Molish 반응) extract 0.1g 을 물 or MeOH 2ml에 용해 → 20% α-naphthol EtOH 용액 2-3방울 첨가 → 황산첨가 후 경계면에 적자색 환 생성 여부 관찰 Phenol 성 물질, flavonoid, tannin extract 0.1g 을 물 or MeOH 5ml에 용해 → 10% FeCl3 EtOH 용액 2-3방울 첨가 후 자색-청색의 정색 여부 관찰

19 단백질, peptide(Biuret반응)
extract 0.1g 을 물 2ml에 용해 → 여과 → 10% NaOH 1ml 첨가 → 1% CuSO3 1-2방울 첨가 후 청색–적자색의 정색 여부 관찰

20 전기영동    1) 물질의 크기 및 분자량에 따라 물질을 분리    2) 물질의 실제 전하에 따라 물질을 분리

21 The First Dimension : Isoelectric Focusing (IEF)
-> pI 값에 따른 단백질의 분리 여러 종류의 혼합된 단백질들이 pH range 3-10 IPG Strip 상에서 단백질의 크기와는 관계없이 pI 값에 따라서만 분리 되어짐

22 The Second Dimension : SDS-PAGE -> 분자량에 의한 단백질 분리
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24 Westernblot

25 불포화 화합물 유기산 extract 0.1g 을 MeOH 5ml로 용해 → 여과
→ 10% Br2빙초산 용액을 가했을 때 Br2의 적색이 소실했는지 여부 관찰 유기산 extract 0.1g 을 MeOH 2ml로 용해 → 여과 → 5% AgNO3 알콜 용액을 가했을 때 침전생성여부 관찰

26 분리방법 I 진출 (shaking out) 용액 A와 이것과 섞이지 않는 용액 B를 가하여 흔들고 A로부터 B에 가용성의 물질을 침출하는 과정을 말한다 이 경우 다량의 B를 1회 사용하는 것보다 소량씩 수회에 나누어 흔들어서 추출하는 것이 효과적이다. 용질 (분산매)이 서로 섞이지 않는 두 종류의 용매(상)에 용해할 때를 분배라고 하며 두 용매(상)에서 용질의 농도가 평형에 도달할 때의 농도비를 분배계수(분배율)라고 한다.

27 분배계수 (partition coefficient), K
큰 부피로 단일 추출에 비해 작은 부피로 여러 번 하는 것이 효율이 더 크다. 용질 A는 toluene과 물 사이에 분배계수 3을 가진다. 0.01M의 수용액 100mL가 toluene으로 추출된다고 가정하자. 500mL로 1회 추출하였을 때 남아있는 A의 분율은 얼마이며 100mL로 5회 추출하였을 때 남아있는 A의 분율은 얼마인가

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30 분리방법 II 용액에 대한 용해도 차를 이용한 분리법
Extract를 적당한 용매 (또는 혼탁용매)와 가열하고, 냉각여과하여 불용부 (침전)와 가용부(여액)로 분리하고 각각을 다른 용매로 처리하여 불용부와 가용부로 연속적으로 분리한다. 또 각 분획물에도 여러가지 성분이 섞여있고 동일한 성분이 이쪽 저쪽에 나오게 되므로 각 분획물에 있어서도 다음의 chromatography와 재결정법 등으로 분리와 정제를 행할 필요가 있다.

31 분리방법 II 해리성을 이용한 분리법 중성, 산성, 염기성 등의 물질을 분리하는 경우에는 수층의 pH를 변화시켜 유기용매로 침출한다. 염기를 물로 추출하기 위해서는 B가 BH+가 되도록 pH를 충분히 낮추어야 한다. 산 HA를 물로 추출하기 위해서는 산이 A-가 되도록 pH를 충분히 높여주어야 한다.

32 분리방법 III 염석 (salting out) 납염법 (lead salt method) 효소 분리시 많이 사용
물에 녹더라도 무기염류의 수용액에는 녹기 어려운 유기화합물이 상당히 많다. 이 성질을 이용하여 수용액에 무기염류 (NaCl, KCl, NH4Cl, Na2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4, K2CO3 등)을 가하여 결정을 만들거나, 분배되기 쉽도록 한 방법을 염석이라고 한다. 납염법 (lead salt method) OH기, CHO기, CO기를 가진 물질이 납화홥물과 착염을 이루는 성질을 이용한 추출분리법 Pb(OAc)2의 10% 수용액을 사용하거나 2-3% alcohol용액 염기성초산납 (차초산납) Pb(OAc)2Pb(OH)2의 수용액

33 무기염류와 저분자의 불순물을 제거하는 수단으로 흔히 사용
투석   무기염류와 저분자의 불순물을 제거하는 수단으로 흔히 사용 투석   염석 또는 유기용매로 침전시켜 모은 단백질에는 아직 불순물로서 기타의 단백질이나 저분자물질, 무기염을 함유하고 있다. 저분자의 불순물을 제거하는 수단으로 흔히 사용되는 것이 투석(dialysis)이다.   무기염류와 저분자물질은 투과하나 단백질이나 고분자물질은 투과하지 않는 작은 구멍을 가진 막(셀로판 튜브 등)에 단백질 용액을 넣어 봉하고 증류수나 완충액 속에 장시간 넣어 두면 저분자물질은 막에서 투과하여 제거된다 33

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40 정제 (purification I): 수증기 증류 (steam distillation)
Essential oil 추출의 경우 비교적 휘발성이 낮은 화합물을 수증기와 함께 증류시켜 정제하는 과정 방향족 화합물, 고급알코올, 정유 성분의 분리에 가장 많이 이용되며, 서로 극성차가 큰 화합물들은 쉽게 분리할 수 있다.

41 정제 II 탈색 (decoloration) 승화 (sublimation)
산화와 환원에 따른 탈색은 목적성분을 변화시킬 위험성이 크다. Chromatography :착색물질을 활성탄 (charcoal), alumina, silica gel 등에 흡착 납염법 Ion exchange :식물체는 chlorophyll, 해양식물의 경우는 fucoxanthine류 승화 (sublimation) 유지, 탄수화물, 염류를 제외한 대다수의 유기화합물은 상압, 감압하에서 승화한다. 혼합물을 승화기구에 넣고 외부에 열을 가하면 상온 상압하에서 비교적 높은 증기압을 가지는 물질은 곧 찬공기와 만나서 결정화되므로 쉽게 분리할수 있다. Quinone류, 산 무수물, ketone, carboxlate, amino acid 등도 승화하기 쉽다. 일반적으로 상압하에서보다 감압하에서 행한다. 승화에 의한 정제는 재결정법과 같이 모액중에 남아있거나 탈색에 사용한 활성탄의 흡착과 같은 손실은 적다.

42 정제 III 재결정 (rechrystallization) 고체물질을 최종적으로 정제하는 것이 가장 유력한 방법
저온에서 용질의 용해도를 낮추면 결정화가 일어난다. 천연물에서는 결정 모액의 검사도 필요하다, 다른 성분이 함께 결정으로 석출되는 경우는 재결정법으로는 분리할 수 없다. 일반적으로 acetone, CHCl3, CH2Cl2, EtOAc, ether, ethanol,등을 사용하고 특히 융점이 낮은 화합물들의 경우 CH2Cl2와 ether를 많이 사용한다.

43 Chromatography I 1980년 소련의 식물학자, 생화학자 Tswett 식물의 잎사귀에 존재하는 색소를 분리시도
Inulin등의 여러 흡착제를 충진시킨 column에 petroleum ether로 추출한 잎사귀 추출액을 소량 가하고 동일 용매로 용리 (elution)시켰을 때 서로 다른 색깔의 띠를 확인 희랍어어원 color + write = chromatography 고정상 (stationary phase)과 이동상 (mobile phase) 간의 흡착 (adsorption) 또는 분배 (partition)를 이용한 분리법 이동상 : column을 통해 이동하는 용매는 액체 혹은 기체 고정상 : column 안에 머물러있는 상은 보통 모세관 내벽에 혹은 column에 충전된 고체입자 표면에 덮여진 점도가 있는 액체 혹은 고체입자

44 Chromatography II 이동상의 종류에 따른 분류
Gas chromatography (GC), Liquid chromatography (LC) 고정상의 종류에 따른 분류 흡착형 (고체인 경우) & 분배형 (액체인 경우) 고정상의 극성, 이동상 용매의 극성의 크기에 따른 분류 Normal phase chromatography (순상) Reverse phase chromatography (역상)

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46 Chromatography III 이동상과 고정상 사이의 상호작용기전에 따른 분류
1) 흡착 크로마토그래피 (absorption chromatography) 가장 오래된 형으로 고체 고정상과 액체나 기체의 이동상을 사용한다. 용질은 고체입자의 표면에 흡착되며 고정상과 이동상 사이의 평형으로 용질분자는 서로 분리된다.

47 2) 분배 크로마토그래피 (partition chromatography)
고정상은 고체 지지체 표면에 형성된 얇은 막이며 용질은 고정상 액체와 이동상 사이의 분배평형을 이룬다. 특히 혼합물을 분리할 뿐만 아니라 표준물질과 직접 비교 용매증기에 포화된 여지, 또는 박층 (고정상)간의 분배율의 차에 의해서 분배가 행하여지기 때문에 여지 크로마토그래피를 paper partition chromatography 라 하여도 무방하다

48 3) 분자배제 크로마토그래피 (molecular exclusion, gel filtration, gel permeation chromatography)
용질의 크기가 크면 클수록 더 빨리 통과되므로 크기에 따라 분자들을 분리 (구멍의 크기는 큰 용질 분자를 배제하기에 충분하도록 작으나 작은 분자를 배제할 정도로 작지는 않다) 다른 형태의 gel과는 달리 고정상과 용질 사이에 인력이 없다 많은 부피의 elution용액이 필요하다

49 4) 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography)
가장 선택적인 크로마토그래피 방법 고정상에 공유결합된 분자와 용질 중 한 성분이 특별한 상호작용으로 결합함으로서 다른 용질들과 분리하는 방법 공유결합된 분자가 특별한 단백질에 대해 항체인 경우 다양한 단백질을 포함한 혼합물을 column을 통과할 때, 단지 항체에 반응하는 하나의 단백질만이 고정상에 결합되고 나머지는 먼저 elution된다. 항체와 결합된 단백질은 pH변화시키거나 이온세기를 변화시킴으로서 회수된다.

50 5) 이온교환크로마토그래피 (Ion exchange chromatography)
강목구조의 탄화수소에 산성기 또는 염기성기를 연결한 이온교환수지에 양이온 또는 음이온을 접촉하면 물에 불용인 채로 이온교환이 이루어져서 그 이온이 수지와 결합한 대신으로 H+ 또는 OH- 가 용출. 해리기가 산성 : 양이온 교환수지 cation exchange resin 강산 (-SO3H), 약산 (-PO3H, -COOH, phenol성 –OH) 해리기가 염기성 : 음이온 교환수지 (anion exchange resin) 강염기 (-N(CH3)3OH, -N(CH2OH)(CH3)2OH), 약염기 (-NH2, -NH-, phenylamine) 용도 alkaloid의 혼합물, Peptide나 단백질의 가수분해물과 같은 수종의 amino acid의 혼합물과 같이 특히 해리성에 근사한 물질도 각각의 완충액의 사용과 피흡착성의 차에 따라서 뚜렷하게 분리 (amino acid autoanalyzer) 공업용수의 연화, 순수한 물의 정제, isotope의 분리제조, 의약용, 촉매용 등

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52 Gel chromatography 1) 원리
Gel 입자는 3차원적 망상구조를 가진 고분자 화합물로서 분자 내 일정크기의 구멍이 존재한다. 구멍의 크기는 gel분자를 합성할 때 가교도 (cross linkage)에 의해서 결정되며 가교도를 적당히 조절하면 크기가 다른 구멍을 가진 gel을 합성할 수 있다. 가교도가 큰 gel은 구멍의 크기가 적고 가교도가 낮은 gel은 구멍의 크기가 크다. gel층을 시료가 통과할 때 gel 속의 구멍보다 크기가 적은 분자는 구멍 속으로 들어가게 되지만 크기가 큰 분자는 용매와 함께 이동하기 때문에 빨리 용출하게 된다. 2) 장점 다른 종류의 chromatography에 비해서 분리과정 중 화학변화가 일어나거나 흡착에 의한 물질의 손실이 거의 없으며 분석시간이 비교적 짧다.

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55 3) Gel의 종류와 성질 Silica gel, cellulose, ion exchange resin (이온교환수지), sephadex (고분자 gel), reverse phase, normal phase Gel에 사용되는 용매는 물, 유기용매 또는 양자를 모두 사용할 수 있으나 gel의 종류에 따라서 선택되어진다. Gel의 재료는 유기계 gel 과 무기계 gel로 나뉠 수 있다. 유기계 gel : dextran, agarose 등 천연고분자를 가공한 것과 polystylene 계 polyacrylamine계 등의 합성 고분자가 있으며 무기계 gel로서는 다공질 glass, 다공질 silica 등이 있다 친수성기를 가진 천연고분자 gel과 acrylamine계의 gel은 물을 용매로 사용하고 친수성기를 가지지 않은 합성고분자gel의대부분에는 유기용매를 사용한다. 무기계 gel과 sephadexLH20등 일부의 유기계 고분자gel에는 양자모두를 용매로 사용할 수 있다. SephadexLH20은 극성이 낮은 용매를 사용할 때 Phenol, 카르본산 등과 흡착성이 크다.

56 GEL충진제의 종류 충진제 제품명 구멍의크기 용출용매 천연고분자GEL 가교 Dextran Sephadex G
700 ~ 2  105 물 Sephadex LH-20 10,000 물, 유기용매 Agarose Bio-gel A 40,000 ~ 1.5  108 Sepharose 3  106 ~ 2.5  107 Sagavac SAG 2.5  105 ~ 1.5  102 합성 고분자 GEL 가교 polystyrene Bio-beads S-X 1.4  103 ~ 4.1  108 유기용매 Styragel 1.6  104 ~ 4.0  108 가교 polyacrylamide Bio-gel P 2,000 ~ 4.0  105 무기 GEL 다공성 silicagel Porasil 6  104 ~ 2  106 다공성 glassbeads Bio-glass 200 ~ 2,500 A

57 Paper chromatography (여지 크로마토그래피, PC)
고정상 담체로서 여과지를 이용하여 밀폐시킨 용기에 이동상용매를 전개시킴으로서 혼합물을 분리하여 정색시약이나 자외선에 의해 여지상에서 관찰 여지에 함유되어있는 물과 전개용매 사이의 분배를 이용 주로 탄수화물, 당류, 아미노산, 핵산의 염기, 유기산, phenol성 물질 등 극성이 큰 수용성 물질의 분리에 적합 물질의 이동도 (Rf치)의 비교적 높은 재현성 검출강도는 수 g으로 미량 물질의 분리, 검출, 확인 또는 정량 등에 이용

58 Thin layer chromatography I (박층 크로마토그래피, TLC)
흡착제를 균일한 박층 (두께 mm)으로 만들어 사용 TLC plate : glass, metal, plastic sheets 흔히 silica gel 혹은 alumina 박층을 사용 지용성 물질 분리에 적합 장점 분해능이 좋으며 분석소요시간이 짧다 용매, 발색시약에 제한이 없어 여러 종류의 물질 분석에 이용 간단하고 빠르며 경제적인 화합물 확인 방법 혼합물 내의 화합물의 수를 확인 표준물질과 Rf 치를 비교 : 혼합물내의 화합물의 종류를 확인

59 Thin layer chromatography II (박층 크로마토그래피, TLC)
Preparation Developing chamber, Capillary tube, TLC plate, UV lamp Filter paper, Sample solution, Mobile phase (developing solvents) etc Chamber Lid가 있어 전개용매가 전개조 내에 균일하게 포화되어야 함 필요에 따라 필터를 전개조 내에 넣어 용매를 포화시킨다 전개용매는 바닥에서 0.5 – 1 cm내외로 한다. 혼합물의 전개를 쉽게 확인할 수 있도록 투명전개조 사용 TLC plate Precoated Merck Kiesel gel 60 F254 plate 0.25, 0.5, 1 mm 두께의 TLC가 있다 5 cm or 20 cm x 20 cm sheets.

60 Preparation of a developing chamber and TLC plate
Thin Layer Chromatography - TLC Study Questions/Answers from the Handbook for Organic Chemistry Lab TLC is a simple, quick, and inexpensive procedure that gives the chemist a quick answer as to how many components are in a mixture. TLC is also used to support the identity of a compound in a mixture when the Rf of a compound is compared with the Rf of a known compound (preferrably both run on the same TLC plate). A TLC plate is a sheet of glass, metal, or plastic which is coated with a thin layer of a solid adsorbent (usually silica or alumina). A small amount of the mixture to be analyzed is spotted near the bottom of this plate. The TLC plate is then placed in a shallow pool of a solvent in a developing chamber so that only the very bottom of the plate is in the liquid. This liquid, or the eluent, is the mobile phase, and it slowly rises up the TLC plate by capillary action. As the solvent moves past the spot that was applied, an equilibrium is established for each component of the mixture between the molecules of that component which are adsorbed on the solid and the molecules which are in solution. In principle, the components will differ in solubility and in the strength of their adsorption to the adsorbent and some components will be carried farther up the plate than others. When the solvent has reached the top of the plate, the plate is removed from the developing chamber, dried, and the separated components of the mixture are visualized. If the compounds are colored, visualization is straightforward. Usually the compounds are not colored, so a UV lamp is used to visualize the plates. (The plate itself contains a fluor which fluoresces everywhere except where an organic compound is on the plate.)

61 Thin layer chromatography III (박층 크로마토그래피, TLC)
Preparation of Sample solution 용액의 농도가 약 1% or 1 gram in 100 mL되도록 만든다 1 mg in a few drops : 정확할 필요가 없다 사용하는 용매는 시료가 잘 녹은 것을 선택하되 휘발성인 것을 사용 (Hexanes, ethyl acetate, or methylene chloride) 농도가 너무 진하거나 연하면 물질을 확인할 수 없다 이 경우 시료를 희석하여 다시 TLC한다 Spotting of Sample solution 모세관 혹은 microtube를 사용 TLC coating이 손상되지 않도록 조심하며 Spot 의 직경이 너무 크지 않게 loading 너무 넓게 loading하면 각 화합물의 spot이 겹치게 되어분리가 효율적이지 않다

62 Spotting of sample on TLC plate

63 Thin layer chromatography IV (박층 크로마토그래피, TLC)
UV detector 시료에 색이 있을 경우 : 탈색되기 전에 연필로 표시 시료에 색이 없을 경우 : UV lamp를 사용하여 육안으로 확인할 수 없었던 spot에 연필로 표시 보통 장파장 (365 nm)과 단파장 (254 nm)으로 구성 장, 단파장에서 detect되지 않는 시료인 경우 정색반응 시행 Mobile phase, developing solvent Rf value : 0.2 ~ 0.7, 둥근 spot 분리 혹은 정제시 다양한 전개용매를 사용할 필요가 있다. 구조내 OH (hydroxyl) group이 많은 화합물 : tailing현상 산을 첨가하면 바람직한 TLC analysis 가능

64 Identification of sample on TLC plate

65 Thin layer chromatography V (박층 크로마토그래피, TLC)
Rf (retardation factor) value Rf depends on the following parameters: solvent system absorbent (grain size, water content, thickness) amount of material spotted temperature

66 표준물질과 Rf치 비교 : 미지물질을 확인 Rf stands for "ratio of fronts" and is characteristic for any given compound on the same stationary phase using the same mobile phase for development of the plates. Hence, known Rf values can be compared to those of unknown substances to aid in their identifications.

67 정색시약을 이용한 검출법 I Alkaloid 당
Extract 0.5 g/10% HCl 20-30ml ml ether (진탕) 수층을 분리하여 10% NH4OH로 alkali성으로 한 다음 CHCl ml로 진탕하여 CHCl3을 취하고 증발 농축한 후 소량의 10% HCl에 용해, 여과후 Mayer시약에 의한 백색 침전의 생성 여부 관찰 Mayer시약: HgCl21.4 g + KI 4.9 g/H2O 100ml 당 Extract 0.1 g/H2O 2ml 여과한 후 Fehling 시약 5 ml에 가하고 가온할 때 적색 침전의 생성여부를 관찰 비환원성당 또는 배당체는 검액을 10% HCl로 가수분해하고 중화한 후 시험 Fehling 시약 A액 (CuSO45H2O 7g/H2O 100ml)과 B액 (sodium potassium tartate 35 g과 NaOH 100g/H2O 100ml)을 미리 만들어 시험직전에 같은 양을 혼합하여 사용한다

68 정색시약을 이용한 검출법 II 배당체, 탄수화물 (Molish반응) Phenol성물질, flavonoid, tannin
Extract 0.1g을 H2O 또는 MeOH 2ml에 녹이고 20% -naphthol EtOH용액 1-2방울을 적가한 후 농황산을 기벽을 통하여 가할 때 경계면에 적자색환이 나타나는가 관찰 Phenol성물질, flavonoid, tannin Extract 0.1 g을 MeOH 3ml에 녹이고 HCl 0.2 ml를 가한 다음, Mg 분말소량을 가하고 실온에서 방치할 때 황적색-적색으로 정색 Extract 0.1g을 H2O 또는 MeOH 5ml에 녹이고 10% FeCl3 EtOH 용액 1-2방울 적가할 때 자색-청색의 정색 Extract 0.1g/ H2O 혹은 MeOH 5ml + 10% NaOH 1ml 을 가하여 alkali성으로 할 때 황색-적색으로 정색

69 정색시약을 이용한 검출법 III 단백질, peptide (Biuret반응)
Extract 0.1g을 H2O 2ml에 녹이고 여과한 다음10% NaOH 1ml를 가하여 alkali성으로 한 후 1% CuSO4를 1-2방울 적가후 청색-적자색의 정색관찰 Steroid, terpenoid, saponin (Liebermann-Burchard반응) 유리접시에 무수초산 1방울을 떨어뜨리고 검체 0.5 mg을 용해한 후 주변에 농황산 1방울을 떨어뜨리고 초자봉으로 살짝 접촉시킬 때 양 액의 경계부위가 적색-청색-녹색으로 정색되는가를 판단

70 정색시약을 이용한 검출법 IV 불포화화합물 유기산 정유
Extract 0.1 g을 MeOH 2ml에 녹이고 필요하다면 여과한 다음 picric acid 알코올 포화용액 1ml를 가할 때 혼탁 또는 침전생성여부를 관찰 불포화화합물 Extract 0.1g을 MeOH 5ml에 녹이고 필요하다면 여과한 다음 10% Br2 빙초산 용액을 적가할 때 Br2의 적색이 소실여부 관찰 유기산 Extract 0.1 g을 물 또는 MeOH 2ml에 녹이고 필요하면 여과한 다음 5% AgNO3 알코올 용액을 가할 때 혼탁 또는 침전의 생성여부를 관찰

71 정색시약을 이용한 검출법 V Aniline-Diphenylamine : detecting reducing sugars.
1.8% w/v aniline and 1.8% w/v diphenylamine in acidified acetone Sulphuric acid spray reagent : organic compounds 5% w/v of the acid in ethanol 4-Dimethylaminobenzaldehyde (Ehrich reagent) 1% w/v of the reagent in acidified methanol For detecting amines, indoles, and ergot alkaloids. Dragendorffs reagent For detecting alkaloids and quaternary nitrogen compounds. Ninhydrin 0.2% w/v ninhydrin in ethanol.or in 6% acetone For detecting amino acids, amines, and amino sugars Ninhydrin Fixer reagent Acidified ethanol containing 1% saturated cupric nitrate. ninhydrin chromatograms.