HPLC 이론 및 실험법.

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1 HPLC 이론 및 실험법

2 Chromatography란 ? 혼합된 시료 성분이 이동상 과 고정상 사이를 흐르면서 흡착, 분배, 이온교환 또는 분자크기배제 작용 등에 의해 각각의 단일 성분으로 분리되는 것을 말한다. 분리, 정성, 정량 등의 분석목적과 분리,정제, 분취 목적에 이용된다 Injection Interaction Elution abacbc aabcbc - 크로마토그래피법은 혼합물을 단일물질로 분리하는 방법을 말한다. - 여기서 고정상과 이동상의 두가지 용어가 나오며 그들의 의미는 다음과 같다. 고정상 : 컬럼내 충진된 물질,즉 충전제를 말하며 충전제와 시료성분 과 의 흡착,분배,이온교환,분자크기배제등의 작용에 의해 혼합물이 단일물질로 분리가 일어나는 곳이다. 이동상 : 시료성분을 주입구에서 검출기까지 이동시켜주는 역할을 하며 또한 분석시 시료성분들간의 분리정도에도 영향을 준다. Note :

3 HPLC System의 구성 Mobile Phase Reservoir Pressure Gauge Data System Pump
Pulse Damper Injector Column Detector Fraction Collector HPLC System을 구성하는 기본성분은 다음과 같다. - Pump : 용매저장용기에서 용매를 끌어서 시료주입기로 밀어주는 역할 을 한다. - Injector : 분석하고자 하는 시료를 주입하는 곳이며 또한 컬럼으로 보내기 위한 부분이다. - Column : 다양한 재질의 용기내에 충진제가 채워져 있으며 시료성분들 을 각각의 단일성분으로 분리시켜 주는 곳이다. - Detector : 컬럼에서 분리되어 나온 시료성분의 양에 비례하게 전기적인 신호(signal)로 바꾸어 준다. - Data System: 검출기에서 나온 신호값을 Y축에, 시간을 X축으로 하여 크로마토그램을 그려낸다. - Fraction Collector : 분리된 성분을 순수하게 얻고자 할 때 이용된다. Note : Gradient Device

4 Solvent Delivery System (Pump)
용매의 저장용기에서 용매를 끌어서 시료주입기로 밀어주는 역할 1. Pump의 요건 a. 일정한 유속과 압력 유지. b. 가동이 쉽고 다양한 용매를 사용할 수 있어야 함. 2. Waters Pump의 특징 a. 정확한 유속과 유량 조절 b. Pulse 방지를 위한 system (Gear 방식으로 Cam 방식보다 Pulse가 적다.) c. 가동이 쉽고 여러 용매 사용 가능. d. Isocratic에서 Gradient까지 사용. e. 내구성이 우수. Pump의 주요기능은 이동상으로 사용되는 용매들을 원하는 비율로 잘 혼합하여 균일하게 섞이게 한뒤 시료주입기로 밀어주는 역할을 한다. - 이때 펌프의 성능이 좋을수록 , 즉 일정한 유속과 압력이 유지되어야 실험결과(예: Retection time)의 재현성을 얻을 수 있다. - 또한 다양한 용매를 사용할 수 있어야 그에 따른 다양한 시료분석도 가능하게 된다. - Waters Pump는 이러한 Pump의 요건을 갖추고 있으며 특히 Gear방식을 채택하여 pulse의 발생을 최소화하였다. Note :

5 FLOW PATH DIAGRAM High sensitivity accessory Transducer Pump outlet
Solvent revervior filter High pressure filter Tee Outlet check valve Outlet check valve Left pump head Right pump head Mechanical drive Inlet check valve Inlet check valve 이동상이 흐르는 펌프의 유로를 나타낸 그림이다. Note : Inlet manifold assembly Solvent drawoff assembly

6 분석시 이동상조성에 따른 분류 일정용매조성법 ( Isocratic Mode) ; 분석시간 동안 용매의 조성이 바뀌지 않는다.
분석시 이동상조성에 따른 분류 일정용매조성법 ( Isocratic Mode) ; 분석시간 동안 용매의 조성이 바뀌지 않는다. 구배용매조성법 ( Gradient Mode) ; 분석시간 동안 용매의 조성을 여러 가지 형태로 바꾸어 줄 수 있다. - Single pump ; Low pressure - Multiple pump ; High pressure 분석시 사용되는 이동상의 조성변화에 따라 두가지모드로 분류할수 있다 - 일정용매조성법 : Isocratic mode로 분석시간동안 일정한 조성을 갖는 이동상이 흐르게 된다. - 구배용매조성법 : Gradient mode로 분석시간동안 용매의 조성을 여러가지 형태로 바꾸어줄 수 있으며 그 형태는 아래와 같다. Note :

7 일정용매 조성법( Isocratic Mode)
pump detector column ---- solvent resorvoir injector - 가장 간단한 형태의 구성이며 한 pump가 일정조성의 용매를 밀어 줌으로 실험 중 용매의 조성이 바뀌지 않는다. 분석시간동안 용매의 조성이 일정한 것을 말한다. - 즉 이동상이 60% ACN / 40% H20 인 경우 분석시간동안 이 조성을 유지하면서 분석이 진행되는 것이다. - 복잡한 화합물인 경우 여러가지 컬럼을 교체하여 분석하여도 분석이 안 될 경우에는 분석시간동안 용매의 조성을 바꿀 수 있는 다른 모드 즉 Gradient Mode를 사용해야 한다. Note :

8 구배용매 조성법 (Gradient Mode) Gradient Mode는 분석 동안 용매의 조성을 바꾸어 줄 수 있을 뿐만 아니라, 시간에 따른 변화 및 그 형태 까지도 변화시킬 수 있다. 1) Single pump Low pressure solvent A pump solvent B mixer 복잡한 화합물을 분리할 경우 사용하는 용매의 강도를 변화시킴으로써 분리도를 개선하고 분석시간을 단축할 수 있는데 이러한 방법을 Gradient Mode라 한다. Gradient Mode는 두가지로 나뉘어 질 수 있다. - Low Pressure Gradient Formers : 용매의 조성을 변화하기 위해 2개 내지 그 이상의 용매들을 섞는 mixer가 펌프 앞부분에 있으며 이때 용매는 low pressure상태에서 섞이게 된다. 이러한 형태는 1개의 High Pressure Pump를 사용하여 Gradient가 가능하며 값이 저렴하고 사용이 간편한 장점이 있지만 단점으로는 용매를 완전히 degassing시킨 뒤 사용해야 한다. 만약 bubble이 pump로 들어갈 경우 유량의 정밀도에 영향을 줄수 있고 펌프도 치명적인 손상을 받을 수 있다. Note :

9 2) Multiple pump High pressure solvent A solvent B pumpA mixer pumpB
- High Pressure Gradient Formers : 분석시 사용되는 용매가 각각의 다른 High Pressure Pump에 연결되어 있으며 컬럼 앞부분에 연결된 mixer에서 즉 high pressure상태에서 용매는 섞이게 된다. 장점으로는 각각 펌프의 outlet을 독립적으로 programming하여 컬럼으로 이동상이 들어가기전 mixer에서 용매들을 섞어주므로 모든 형태의 gradient mode가 가능하나 단점으로는 별도의 gradient controller가 필요하므로 가격이 비싸다. Note :

10 이동상에 시료를 loading 하여 Column으로 보내는 역할
Injector 이동상에 시료를 loading 하여 Column으로 보내는 역할 Injector의 종류 1. Rheodyne injector (Valve injector) 2. U6K injector (Syringe & Valve Mixed injector) 3. Automatic injector 시료주입기가 갖추어야 할 요건은 다음과 같다. - 사용하기가 편리해야 한다. - 시료가 컬럼에 좁은 띠형태(일반적으로 컬럼 dead volumn의 1/100이하)로 주입되어야 피크의 broadening현상을 최소화할 수 있다. - 결과의 재현성이 있어야 한다. - high back pressure상태에서도 작동이 가능해야 한다. 시료주입기의 형태는 크게 위와 같이 3가지로 나뉘어 지며 U6K Injector는 현재 단종되어 공급되지 않는다.

11 Rheodyne injector 1. 주입량이 loop에 의해 정해짐, 주입량 변화 시 loop 교체
2. Sample loop 세척이 요구 Reodyne injector는 sampling valve형태를 갖는 주입구이다. - 장점 : 신속하고 재현성있는 결과를 얻을 수 있으며 주입시 분석자의 주입기술에 따라 발생하는 주입량의 오차를 최소화할 수 있다. - 단점 : 시료주입량이 변할 때마다 그 양에 맞는 loop를 선택하여 설치하여야 한다. - Reodyne injector사용시 syringe는 항상 reodyne 전용을 사용해야 하며 규격은 외경 inch, 길이 2inch이고 바늘 끝이 직각으로 뭉툭하다. - 밸브의 재질은 2가지 즉 스테인레스 스틸과 PEEK재질이 공급되며 분석에 알맞은 것을 선택하여 사용한다. Note :

12 Auto Injector 1. Free injection 으로 실험실 생산성 향상 2. 96 Step의 조건 입력 가능
3. 4 mL vial : 48개, 1 mL vial : 96개 사용함에 따른 무인 가동으로 분석시간 단축 4. 온도조절 가능 : 최대한 시료 변성 줄일 수 있음 5. 주입량에 따른 오차가 거의 없음 : 재현성 우수 6. Auto priming 및 Auto needle washing 이 가능함 - Heater나 cooler를 장착하여 시료가 들어있는 바이얼부분의 온도를 4 - 40C 범위로 조절이 가능하다. - needle wash pump의 auto-priming이 가능하며 또한 시료들의 연속적인 주입시 발생할 수 있는 주사기의 오염을 방지하기 위한 auto-needle washing이 가능하다. - Auto Standards 기능이 가능하다. : 이 기능을 사용하게 되면 먼저 standards를 주입하고 시료들을 주입한뒤 다시 같은 standards를 주입할 수 있다. - Auto Addition기능이 가능하다. : common vial과 sample vial에 들어 있는 용액의 일정양을 각각 취하여 혼합한 뒤 그 총양을 컬럼에 주입하는 기능이다. 이 기능은 유도체시약이나 표준물등의 자동적인 첨가등에 유용하게 사용될 수 있다. Note :

13 컬럼 입자 크기 재질 형태 : Spherical, irregular Pore 크기 : 50 Å ~ 300 Å
3.5μm, 4μm, 5μm, 6μm, 7μm, 10μm, 37μm, 55μm, 75μm 재질 Silica, Alumina, Silica-Bonded, Polymer(resin)-Bonded 형태 : Spherical, irregular Pore 크기 : 50 Å ~ 300 Å 분류 형태 입자크기 Pore 크기 uBondapak ; Irregular 10um 125A Bondapak ; Irregular 15-20um 125,300A Delta-Pak ; Spherical 5,15um 100,300A Nova-Pak ; Spherical 4,6um 60A Porasil ; Irregular 5,10um 85A Resolve ; Spherical 5,10um 90A Symmetry ; Spherical 3.5,5um 100A SymmetryShield ; Spherical 3.5,5um 100A SymmetryPrep; Spherical 7um 100A

14 충진제의 특성 Pore size & Distribution :
Small Pore = higher efficiency = less band broadening Spherical or Irregular : Irregular = higher Surface area = higher carbon load Spherical = lower pressures = longer life Spherical = better structural stability = longer life Particle size Smaller particle = higher operating pressure = higher efficiency - 컬럼의 효율은 작은 pore size와 particle size, irregular type일 경우에 좋아진다. 그러나, 컬럼의 수명면에서 본다면 irregular type보다는 sphrical type이 좋다.

15 컬럼의 종류 재질에 따른 분류 분리 기작에 따른 분류 Steel 컬럼 PEEK 컬럼 Radial-pak 컬럼 순상컬럼 역상컬럼
재질에 따른 분류 Steel 컬럼 PEEK 컬럼 Radial-pak 컬럼 분리 기작에 따른 분류 순상컬럼 역상컬럼 이온컬럼 크기배제컬럼 - PEEK ; polyetheretherketone - Radial-pak 컬럼은 카트리지형태로 구성되어 있다.

16 재질에 따른 분류 Steel 컬럼 PEEK (polyetheretherketone) 컬럼
Steel 카트리지 컬럼 - End fitting 장치 PEEK (polyetheretherketone) 컬럼 플라스틱 Radial-Pak 카트리지컬럼 방사압축기술

17 1. Normal Phase(순상, 흡착작용) Functional group의 polarity에 의한 분리이다.
일반적으로 non-aqueous, non-polar solvent를 사용한다 ; 극성이 큰 물 질이 가장 나중에 용출된다. Si-OH Si-OH---OH O Hexane polar - Polarity가 큰 물질 일수록 용출되는 속도가 느려진다. - 용출속도 : naphthalene < phenol - 일반적으로 Normal phase column을 사용한 경우 polar한 물질분석 시 tailing현상이 크다.

18 순상 충전컬럼의 종류 Silica Phase Bonded Phase
Resolve Silica, uPorasil, Nova-pak Silica Bonded Phase Nova-pak CN, NH2 u-Bondapak CN, NH2 Resolve CN, NH2

19 2. Reverse Phase(역상,분배작용)
Bonded compound(C18, C8, CN, ph)와 분석물질간의 상호작용에 의한 분리 비극성이 큰 물질이 가장 나중에 용출된다 CH3CN/H2O - 현재 가장 많이 이용되는 컬럼의 형태이다. - 주된 분리기작이 Van der Waals힘이므로 많은 수의 복잡한 물질을 분리할 때 효과적이다. -Si-O-Si-C18 -- non-polar OH

20 역상 충전 컬럼의 종류 u-Bondapak C18, CN, Phenyl Resolve C8, C18, CN, Phenyl
Lichrosorb RP-18, RP-8 Deltapak C18, C8 Symmetry C18, C8 Symmetryshield C8 - C18컬럼 %Carbon endcapping uBondapak 9.8 Y Resolve N Lichrosorb N Deltapak Y Symmetry Y *Symmetryshield RP Y - C18은 아직 없음

21 C18 Column 제조방법 Silica (SiO2) Acid Treatment Free Silanol (Si-OH)
Chemical Bonding of C18 End-capping by TMS Element Analysis - Carbon loading Column V Si D(g/ml) Mass % Carbon C amount(g) Novapak 1.8ml uBondapak 1.8ml

22 End-capping이란? TMS-Cl -Si-O-Si-C18 -Si-O-Si-C18 -Si-OH non-polar
-Si-O-Si-(CH3)3 non-polar -End-capping의 효과 end-capping을 하면 -NH2와 같은 염기성 시료의 분석시 문제가 되는 peak의 tailing현상을 줄일 수 있다. 왜냐하면 SiOH의 분자구조를 가지고 있으면 산으로 작용하여 SiO-형태의 음이온구조를 형성하게된다. 이 음이온은 중성의 mobil phase를 사용하여 분석을 할때 염기성시료와의 상호작용으로 말미암아 peak broading이나 tailing의 효과를 형성하게 된다. 이러한 작용은 염기성시료를 분석할때 많은 제약을 가져오게 되어 현재는 많은 컬럼에서 end-capping을 하고 있다. -Si-O-Si-C18 -Si-O-Si-C18

23 3. Ion Exchange(이온 교환 작용) ; 이온화도의 차이에 의해 분리 된다.
- - - + counter ion + - sample + - - + + -

24 이온교환 컬럼의 종류 IC-pak Anion/Cation SAX(Strong Anion Exchenger)/SCX
Protein-pak DEAE/SP HR

25 D. Size Exclusion(분자체 작용)
충전제의 종류 : Styrene divinylbenzene 일정크기의 pore를 가진 충전물을 사용 분리원리 physical적인 분리방법 경로차에 의한 분리 큰 분자가 가장 먼저 용출되고 작은 분자 가 가장 나중에 용출된다. 응용 : 고분자의 분자량 및 분포도를 구함.

26 분자체 column의 종류 GPC : Styragel HR, HT, HMW Series
Aqueous GPC : Ultrahydrogel Series Aqueous GFC : Protein-pak Series

27 컬럼선택의 일반기준 분자량 > 2000 < 2000 Y Hexane Silica, Porasil
Organic Sol. N Y N Y MeOH CN, Ph, C8, C18 Water N Y THF Y Styragel HR, HT, HMW N Ultrahydrogel Protein-pak Y IONIC NR3, COO, SO3

28 컬럼 효율 계산(이론단수) - 5sigma법이나 tangent법이 많이 사용된다.

29 분리도(능)(Resolution) R=1/4(α-1/α) SQRT(N){k`2/(1+k`av)}
α : 선택성 인자 N : 이론단수 (컬럼의 효율) k`2 : 머무름이 더 큰 성분의 용량인자 k`av :두성분의 평균 용량인자

30 Detector 컬럼에 의해 분리된 시료의 양에 비례한 전기적 신호를 만든다
구비 요건 1. Signal to noise ratio (S/N ratio) 가 높을 것 2. Noise , Drift 가 적을 것 3. Detection limit 가 낮을 것 4. Flow rate , temperature , pressure 에 안정할 것 검출기가 갖추어야 할 구비요건은 위사항과 같다. - RI는 Gradient Mode를 사용할 수 없다. - Linear range가 넓은 검출기를 사용하여야 정량분석을 용이하게 할 수 있다. Note : 5. Gradient 가 가능할 것

31 Detector의 종류 Optical Detector Electrochemical Detector
1. UV/Visible Detector 2. Fluorescence Detector 3. Refractive Index Detector Electrochemical Detector 검출기는 그들의 작동원리에 따라 크게 두가지로 나눌수 있다. - 광학적 원리를 이용한 검출기 - 전기화학적 원리를 이용한 검출기 이들 검출기들은 분석하고자 하는 시료의 특성에 따라 알맞게 선택하여야 한다. Note : 1. Conductivity Detector 2. Electrochemical Detector

32 여러가지 Detector의 특징 Electro- RI UV/VIS Fluorescence Conductivity
chemical Response universal selective selective selective selective Sensitivity micro- gram nanogram picogram picogram nanogram ( typical ) Flow YES NO NO YES YES sensitivity 위 표는 여러가지 검출기들의 특성을 나열한 것이다. Note : Temperature YES NO NO YES YES sensitivity

33 자외선/가시선 검출기 A = εbc ( Lambert- Beer’s Law )
광원에서 특정 파장의 빛이 광이나 장치를 거쳐 cell내의 시료에 투사되면 일부는 흡수되고, 일부는 시료를 통과하게 되는데 , 특정한 시료는 특정파장 의 빛에 대한 흡광도가 높아서 시료를 투과하는 빛의 강도는 상대적으로 작아지게 된다. 이 때 흡수되는 빛의 양(A)은 - 용액내의 흡광 시료의 농도 (C)에 비례하고 , - 빛의 파장과 , 시료의 특징적인 흡광 spectrum( Molar Absorptivity ) , - 빛이 시료를 통과하는 거리 (path length , b ) 와 관계가 있다. 따라서 Photodiode에 도달하는 특정파장의 빛의 양과 , 시료의 농도 사이의 관계를 나타내면 다음과 같다. 가장 일반적으로 사용되는 검출기이다. - UV-VIS광의 흡수에 기본을 두고 있으며 이때 각 성분은 그들이 갖는 작용기의 종류나 주변환경에 따라 특정파장에서 광선을 흡수하며 흡수정도는 시료농도의 양에 비례하게 된다. - UV-VIS광을 흡수하는 물질들은 ㅠ-bonding electrons나 비공유전자들을 가져야 한다. 예) olefins, aromatics, >C = O, >C=S, -N=N-등을 갖는 화합물 -안정화되는 시간이 짧아 사용하기 간편하다. Note : A = εbc ( Lambert- Beer’s Law )

34 종류와 구조 1) Fixed type 2) Variable type
- 광원 (Lamp)에 따라 정해진 몇 개의 파장만을 사용할 수 있다 - Wavelength : 214, 229, 254, 265, 280, 313, 340, 405, 436, 546 nm 2) Variable type nm 사이의 모든 파장 중에서 원하는 파장을 지정하여 사용한다 - Fixed type은 검출하고자하는 파장에 따라 lamp를 교체하여야 한다. Note :

35 3) Photodiode Array Type
nm 의 전 파장을 동시에 scan 한다. PDA 검출기의 특장점 1. detection range : nm의 total wavelength scanning 2. identified the purity or homogenity of the single peak. 3. sensitivity : signal-to-noise(S/N ratio) (1) detection limits :S/N=2 or 3 (2) processing limits : S/N=10 4.특징 (1) signl-to-noise의 향상된 uv/vis detector (2) optics design : AU의 noise까지 검출 (3) Taper-beam cell (4) standard : 8uL cell volume, option : 2.4uL cell volume :보다 높은 signal (5) optical : 3nm, diode: 1nm resolution : 유사한 파장의 구별 , 미세한 구조 파장 검출 Note :

36 형광 검출기 1) 원리 Exitation filter를 통과한 빛은 sample cell에 존재하고 있는 시료 분자
를 excited state로 만들어 주고 , ground state로 떨어지면서 흡수한 파장보다 긴 파장의 빛을 방출하게 된다. 시료는 분자구조가 형광성을 띠거나 형광 유도체를 만들었을 때 이용 하며, 시료에서 발광하는 빛의 양은 시료의 농도에 비례하며 발광량에 따른 전기적 신호의 크기가 정량의 척도가 된다. 2) 형광 물질 - 형광검출기는 형광성을 갖는 시료에 대해 매우 선택적으로 또한 높은 감도로 분석이 가능케하는 검출기이며 응용범위는 다음과 같다. - 응용범위 : 유도체화된 아미노산, carbamate, PAH, Vitamine(E), Riboflabin - UV-VIS검출기에 비해 100배 정도 감도가 뛰어나다. - 특히 압력과 온도의 변화에 대해 비교적 안정한 검출기이다. Note : Benzene 고리 치환물 중 작용기가 -OH, -OCH3, -H2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -F, -CO 등인 화합물

37 3) 구 조 Photomultiplier Tube Emition Grating Emission Slit Mirror
Collection Flow Cell Mirror Beam Splitter Exitation Exitation - 광원의 종류 (exitation radiation에 따른 분류) ; D2 lamp : nm , Tungsten lamp : nm, Xenon lamp : nm - Lamp에서 나온 빛은 exitation grating에서 원하는 단일광으로 만들어진뒤 beam splitter에 의해 하나는 background emission을 측정하는 광으로 다른하나는 시료를 조사하는 광으로 나뉘고 시료를 조사하는 광은 시료성분을 여기상태로 만든뒤 기저상태로 떨어질때 나오는 광을 PMT에서 측정하여 background emission과 시료에서 나온 emission과의 차이를 측정하게 된다. Note : Grating Slit Photo Diode Lamp Focusing Mirror Mirror

38 용매 조건 HPLC grade solvent가 물 인 경우 18 mega ohm이상. Low Viscosity
용매간 섞임 성. (miscibility No. 차가 15 미만 ) 이동상은 고정상을 변화시키면 안 된다. 분리코자 하는 시료는 이동상에 녹아야 한다. UV cutoff, refractive index가 낮은 용매.

39 Buffer 용액의 사용 목적 1) 이온성 시료일 때-이온억제 및 이온 쌍 형성
1) 이온성 시료일 때-이온억제 및 이온 쌍 형성 2) 생리 활성물질의 순수 분리, 정제 시 (pH조절) 3) 이온성 물질 분리 시 이온강도 조절 - Ion exchange : 시료를 이온의 형태로 분리를 시도한다. 분리모드 - ion exchange 보통 이온컬럼을 사용한다. - Ion suppression : 시료를 이온의 형태가 아닌 중성의 분자로 분리한다. 분리모드 - revers phase 보통 역상컬럼을 사용한다. - Ion pairing : 시료를 착물의 형태로 분리한다.

40 이동상 변형제 PIC A / Low UV PIC B Series 목적 :
역상 방법에서 이온성 시료의 분리능을 높일 뿐만 아니라 시료를 비이온화시키기 위하여 사용한다 종류 PIC A / Low UV PIC B Series - PIC A 시약의 종류 Tetraethyl ammonium phosphate Tetrabutyl ammonium phosphate Tetraoctyl ammonium phosphate Tetradecyl ammonium phosphate - PIC B 시약의 종류 Pentane Sulfonic acid Hexane Sulfonic acid Haptane Sulfonic acid Octane Sulfonic acid

41 이동상 제조(I) 용매 준비 HPLC 용 용매 초순수(비저항값 ;18mega ohm) 부피 대 부피 계량
계량 시 volume 비로 계량 후 혼합 용매 성질에 따라 흡열 , 발열 반응 가능 부피비가 달라질 수 있다.

42 이동상 제조(II) Filter 수용성 FILTER(PVDF) 지용성 FILTER(PTFE) WATER로 ACTIVATION
MeOH/적합한 용매로 ACTIVATION

43 이동상 제조(III) 탈기 Degassing 이동상에 용존된 air, oxygen, bubble제거
Vacuum Degassing(진공탈기) 여과 + 탈기 Helium Sparging 직접 이동상에 sparging Ultrasonication(초음파 파쇄)

44 Experiments of HPLC

45 개 요 Chromatography Gas Liquid GSC GLC Column Paper TLC HPLC

46 HPLC - High performance liquid chromatography. - Rapid separation method. - Variety of mobile phase and stationary phase.

47 크로마토그래피의 분리의 원리

48 크로마토그래피의 도식 Chromatogram I. P. COLUMN Recorder Pump Detector M.P.

49 Analitical result from HPLC

50 Experiments 1. 이동상 제조

51 2. Filtration and degassing

52 3. 펌프 내부 기포제거

53 4. Column 확인

54 5. Pump 압력 확인

55 6. Column 누수 확인

56 7. 온도 확인

57 8. UV Detector

58 9. Sample preparation

59 10. Sample filtration

60 11. Injection