분자 생물학 5장. 핵산 취급 기술.

Presentation on theme: "분자 생물학 5장. 핵산 취급 기술."— Presentation transcript:

1 분자 생물학 5장. 핵산 취급 기술

2 핵산 취급 시 주의사항 Activity 유지 (DNA 손상 방지). Purifying DNA (단백질 제거).
Nuclease contamination 방지. Flexible 하므로 조심스럽게 취급. 유리기구 사용금지 (DNA가 유리 벽에 부착). Polyethylene tube 사용.

3 Bacteriophage DNA Isolation
Phage 현탁액에 PEG(Poly Ethylene Glycol) 처리. 원심분리 후 pellet(phage particle)에 TE buffer add. Phenol add. 원심분리 후 phenol 제거(TE buffer 내에 DNA 존재). EtOH(Ethyl alcohol) 2배 첨가. 원심분리 : DNA ppt(침전물) 획득 (EtOH ppt법 : 에탄올 침전 법).

4 Bacterial DNA Isolation
원심분리 후 pellet에 TE buffer add. Cell wall lysis. G(+) Bacteria : Lysozyme. G(-) Bacteria : SDS, Triton x-100. Phenol 처리(단백질 제거). RNase 처리(RNA 제거). EtOH 2 배 add. 원심분리 : DNA ppt(에탄올 침전 법). ※ Yeast와 Fungus: Bacteria와 동일(세포벽 분해: chitinase).

5 Eucaryote (진 핵 생물)의 DNA 분리
Animal cell, Plant cell 원심분리(밀도 기울기). 핵 분리(미토콘드리아, 엽록체 제거). 핵막 Lysis(SDS 또는 Triton x-100). RNase 처리(RNA 제거). Pronase처리(단백질 제거). EtoH 2 vol. 첨가(에탄올 침전). ※ RNA 분리 : DNA 분리 방법과 동일(DNase 처리). ※ 단백질 제거 : Protease, chloroform, pronase, phenol 처리 후, 원심분리 하여 proteine 제거.

6 핵산의 방사선 동위 원소 표지 법 배양학적 방법(배지에 전구물질 첨가). DNA 표지.
증식배지에 [3H] Thymidine, [14C]Thymidine 첨가. 새로 복제된 DNA의 thymine:3H 또는 14C로 표지 됨. ※많은 방사능 량이 필요할 때 : 32P로 표지 함. RNA의 PO3 표지 되므로 RNase 또는 묽은 Alkali 처리: RNA 분해.

7 핵산의 방사선 동위 원소 표지 법 RNA 표지. 증식배지에 [3H]uridine, [14C]uridine 첨가.
Uridine Triphosphate(UTP) 합성. RNA로 중합. ※ DNA, RNA 모두 표지 되므로 DNase처리. ※ dUMP의 methy 화 : dTMP로 전환(DNA로 전환).

8 핵산의 방사선 동위 원소 표지 법(효소학적 방법)

9 Restriction Endonuclease(제한효소)
DNA 분자 내의 특정 염기서열 인식함. 각 가닥의 한 장소를 절단 : 3’-OH와 5’-P 말단 형성. 일부는 회문 구조(Palindrome structure) 인식. Ⅰtype, Ⅱtype 효소.

10 Flush end : Blunt end 평활 말단, 평 편 말단, 단면 말단.
대칭축의 중심 축을 절단 : Sma I , Bal I.

11 Cohesive end : Sticky end
점착성 말단(Bam H1, Eco R1). 대칭축의 일정 염기만큼 떨어진 곳을 절단.

12 제한효소의 절단 부위

13 Agarose gel electrophoresis

14 Restriction Map : 제한효소 지도

15 Double digestion : 이중 절단

16 Plasmid DNA 란? Extrachromosomal DNA. CCC-form DNA.
(Covalently Closed Circle form). Double strand DNA(ds DNA). Replicon. Gene marker. F, R, Col, Tol, 2 um, Ti.

17 Plasmid isolation Bacteria Bacterial Lysate(cell lysate) Clear Lysate
Lysozyme, EDTA ,SDS, Triton X-100 Bacterial Lysate(cell lysate) 원심분리(단백질, RNA, 염색체 DNA 제거) Clear Lysate EtBr-CsCl 평형 밀도기울기 원심분리. Low band isolation n – butannol처리(EtBr제거) Purifyed plasmid DNA (Agarose gel electrophoresis) Ether 처리(n – butanol제거) EtoH 2vol add(에탄올 침전법) Dialysis(CsCl 제거)

18 Plasmid를 이용한 제한효소 단편의 cloning

19 DNA 상보가닥의 분리 전기영동 : DNA 변성 후 Agarose gel electrophoresis
두 가닥으로 분리됨 : mechanism 미 규명. Ribopolymer 방법: DNA 변성(Alkali 방법 또는 Heating 방법). 변성된 DNA에 Polyribopurine add(Inosine,Guanine: Poly I,G) Ribopolymer가 DNA 가닥 내 C, T와 결합. Ribopolymer의 결합량에 따라 밀도 차이가 생김. CsCl 평형 밀도기울기 원심분리 : 두 가닥 분리. RNase 와 Alkali 처리(Ribopolymer 제거).

20 Ribopolymer 방법

21 Blotting에 의한 혼성화 Filter binding technique(필터 결합 기술).
Southern transfer procedure(서던 전이 방법). DNA-DNA hybridizatio (ss DNA prove 사용). Northern blotting. DNA-RNA hybridization(RNA prove, ss DNA prove) Western blotting. DNA –protein hybridization(ds DNA prove 로 사용). 단백질을 전기영동 한 후, DNA를 찾아냄.

22 DNA Transfer

23 Southern (서어던) 전이 기술

24 Southern Blotting

25 Hybridization Procedure
DNA + 제한효소 처리 Agarose gel electrophoresis DNA fragnent NaOH 처리(변성) Nitrocellulose filter로 transfer 32P로 표지 된 prove sol. 에 침지 (변성 DNA 또는 RNA 찾는데 사용) 잘 봉합된 Plastic 안에서 재생 (건조방지,16~24시간,0.15~0.5 M, Tm보다 20~25℃낮게) Washing (결합되지 않는 것 제거) X-선 film (Autoradio graphy)<검게 감광됨>

26 cDNA(Complemantary DNA) 제조

27 Maxam-Gilbert procedure : 화학적 방법
Double strand DNA 제한효소 처리(한 종류 또는 그 이상) 짧은 DNA fragment 32P로 label 변성(90℃, DMSO) HO-3’ 5’-P32(전기영동: 두 가닥 분지) ⅠSol. ⅡSol. Dimethy sulfate처리 Purin염기 methy 화(G가 A의 5배로 메칠화) ⅡA Sol. ⅡB Sol. 묽은 완충액 내에서 hydrazine처리 Hydragen 처리 ⅠA Sol. ⅠB Sol.

28 Maxam-Gilbert procedure : 화학적 방법
2M Nacl에서 C에만 반응 Heating No heating 묽은 산 처리 C+T에 작용 메칠화된 염기제거 (Deoxyribose만 남음) 메칠화된 A제거 (약간의 G 포함) Piperidin 처리 당-인산 결합 절단 (C절편) 당-인산 결합 절단 (C+T절편) 알카리 처리 알카리 처리 당•인산 결합 끊어짐 (G단편) 당•인산 결합 끊어짐 (A+G단편)

29 A+G와 C+T 단편

30 염기서열 규명 : 전기영동 20% Polyacrylamid gel electrophoresis.
8M Urea buffer 사용 (수소 결합방지).

31 염기서열 규명 : 전기영동