MJ Shin, 3M Korea.

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1 MJ Shin, 3M Korea

2 Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M
Petrifilm salmonella Express System 정성분석 시스템 (증균필름디스크) 신속 검출, 생물화학적 검증 가능 증균배지, 증균 supplement, 필름배지, 확정 디스크로 이루어짐 증균 후 필름으로 추정결과 가능 확정 필요시 디스크 사용 제공된 배지 사용하여야 함 식품샘플 외 화장품, 제약, 수의학, 인체감염 검증 등에 사용할 수 없음. Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M

3 Method Overview 2 가지 증균배양법 : High microbial background vs. Low microbial background 2가지 증균배양법 모두 3M Salmonella Enrichment Broth + 3M Salmonella Enrichment Supplement 사용 High microbial background 인 경우만 R-V R10 사용 Single streak method Single incubation temperature of 41.5 ± 1°C

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5 외부 기관 실험 결과 (미 Q lab) - 실험한 식품군에 대하여는 비교 방법과 동일한 결과 위양성 없었음 한번 스트리킹 하는 방법이 기존 스트리킹방법 (4번) 보다 수월 결과 분석 및 판독이 수월 비교 방법 대비 빠른 결과

6 3M SALX Method : Enrichment media
3M Salmonella Enrichment Broth with 3M Salmonella Enrichment Supplement 1 차증균= hours High background samples 2 차 증균 = R-V R10; 0.1 mL into 10 mL incubate for 8-24 hrs. Temp. = 41.5 C  1 Key Attribute 3M SALX System method (combination of SEB +Supplement +Plate + Disk = System) 를을 모두 사용시 살모넬라의 생장을 높이고 다른 미생물의 생장은 저해함 © 3M All Rights Reserved.

7 3M SALX Method – key take aways:
3M Salmonella Enrichment Base Sterilized via steam autoclave (121 C for 15 minutes) pH 보정 필요하지 않음 – 멸균 후 어두운 황색으로 변함 Key Attribute 일반적 미생물 실험실에서 사용되는 기기 및 기구 사용 만약 멸균 후 pH 가 맞지 않는다면 사용 불가 과멸균이 되었을 가능성 있음. 선택성과 민감도가 떨어지게 됨 DO NOT pH adjust © 3M All Rights Reserved.

8 © 3M All Rights Reserved.

9 Media 제조법 Base 배지 제조: 37.0 g 을 개량하여1.0 L 증류수에 섞음. Autoclave 121°C ,15 분 보충제 Supplement: 상온에 둔 바이얼을 흔들어 파우더가 섞일 수 있도록 해줌. 50 mg (± 2.5 mg) 를 무균적으로 개량하여 멸균된 배지 (20 to 42.5°C 정도로 식힘 후) 에 넣음. Final pH 7.0 ± 0.2 at 25°C.

10 Media 유효기간

11 3M SALX Method – key take aways:
Secondary Enrichment: R-V R10 Can use any R-V R10 as long as formulation is same as specified in IFU Only required for HIGH Microbial Background Samples Incubate for 8-24 hrs. Temp. = 41.5 C  1 Key Attribute R-V R10 formula = RV 보다 약간 낮은 pH 살모넬라 선택 증균 8 ~ 24 시간 증균의 유의적 차이 없음 실험 스케줄에 맞추어 조정 가능 © 3M All Rights Reserved.

12 3M SALX Method – key take aways:
Plate hydration 2 mL sterile RO water, distilled water, Butterfield’s Phosphate Diluent 젤화 시간 : 상온 1시간 Use 3M Flat Spreader 냉동 보관 가능 Key Attribute 1 hour gel time = same as 3M Petrifilm AQUA 3M Petrifilm Staph Express Spreader로 혼용가능 젤화 된 필름은 상온에서 8 시간 방치 가능 -20 ~ -10°C 5일 까지 보관 가능 Hydrated Gel Color Check = 컬러 카드로 바로 확인 가능 © 3M All Rights Reserved.

13 Hydrated Gel Plate Color Card
A Hydrated Gel Plate Color Card는 필름 박스에 포함 운송 중 고온이 노출되었을 가능성을 확인 하기 위해 필름 젤화 후 색 변화 확인 희석액으로 젤화 후 적색이나 밝은 분홍색이면 정상 희석액으로 젤화 후 주황색이나 갈색이면 사용 불가

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15 3M SALX Method – key take aways:
Plate Inoculation 10 uL loop (sterile plastic, new metal, or smooth metal loop) Single streak for isolation Incubation time = 24 hrs  2 hrs. Incubation temp. = 41.5 C  1 Key Attribute 10 uL loop size 로 접종하였을 때 민감도 및 결과가 유효 적게 접종되었을 때는 민감도 보장 어려움 Single streak : quadrant streak, 보다 편리 © 3M All Rights Reserved.

16 3M SALX Method – key take aways:
Presumptive Positives 푸른 콜로니, 녹색콜로니, 청록색 콜로니, 검정 콜로니 (황색존이나 가스방을이 있는 경우에도 추정콜로니 아님) 적색, 적갈색, 진적색 콜로니여도 황색존이나 가스방울없으면 추정콜로니 아님 적갯, 적갈색, 진적색 콜로니에 적색존이 있는경우도 추정콜로니 아님 확정 디스크 삽입 전에 꼭! 추정 콜로니에 표시를 해야함 적어도 5개 이상의 콜로니를 표시 Key Attribute 콜로니 색 컴정표 를 이용하여 검정 가능 Petrifilm EB Plate: yellow acid zone / gas bubble 와 비슷한 해석 방법 콜로니 카운터 사용시 가스 방울은 구별하기 쉬우나 황색존은 구별 어려움. © 3M All Rights Reserved.

17 Colony Color Card Side 1 Side 2

18 3M SALX Method – key take aways:
Biochemical Confirmation 추정 콜로니에 표시한 후 확정 디스크 삽입 Incubate at 41.5C  1C for hours 표시된 몰로니의 색 변화만을 관찰하여 판단 녹색, 청록색, 파란 침전물이 있는 청색, 감청색, 검정색 Key Attribute 디스크는 앞뒤 구분 없음 표시한 콜로니만 확인하면 되므로 추가 분석 간소화 © 3M All Rights Reserved.

19 Method Approvals AOAC PTM and OMA ISO 16140
AOAC PTM = estimated 1Q 2013 AOAC OMA = estimated 4Q 2013 Microval = estimated 4Q 2013 3M is pursuing method approvals recognized globally

20 A Comparative Evaluation of the 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System for the Detection of Salmonella species in Food and Environmental Surfaces AOAC Method Validation 외부 공인 기관에서 실험 아래의 기존의 기준 실험방법과 비교 실험 USDA/FSIS-MLG 4.05 (2011) Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry, Pasteurized Egg and Catfish Products FDA/BAM Chapter 5 Salmonella method ISO 6579: Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of Salmonella spp.

21 Method Validation Procedure Summary:
식품당 20번 반복 One inoculum level: CFU/test portion – Fractional Food Testing 5개의 음성 대조군 : 0 CFU/test portion (un-inoculated) 통계 분석 : Mantel-Haenszel chi square analysis for unpaired test portions and by Probability of Detection (POD) © 3M All Rights Reserved.

22 Organisms for Inoculation:
Matrix Inoculating Organism Raw Ground Chicken Salmonella enterica spp. Heidelberg NCTC 5717 Frozen, Uncooked Shrimp Salmonella enterica spp. Virchow ATCC 51955 Pasteurized Liquid Whole Eggs Salmonella enterica spp. Enteritidis ATCC 13076 Fresh Spinach spp. Saintpaul ATCC 9712 Dry Dog Food Salmonella enterica spp. Poona NCTC 4840 Raw Ground Beef spp. Ohio STS 81* Raw Ground Pork Salmonella enterica spp. Montevideo ATCC 8387 Cooked Chicken Nuggets spp. Typhimurium ATCC 14028 Stainless Steel Environmental Surface Salmonella enterica spp. Kahla ATCC 17980 © 3M All Rights Reserved.

23 Fractional Food Matrices & Comparative Results
Food matrix Petrifilm Salmonella Express Presumptive/Confirmed Reference Method (BAM or USDA) Presumptive /Confirmed ISO 6579 Reference method Raw ground chicken 15/15 14/14 Liquid whole egg 6/6 4/4 5/5 Fresh frozen shrimp 12/12 10/10 Spinach 11/11 Dry dog food 16/16 Raw ground beef 13/13 Frozen chicken nuggets Raw ground pork 9/9 Stainless Steel 7/7

24 Competitive Analysis – 3M SALX System
Petrifilm SALX Plate Powdered or Pre-poured Agar (Selective/ Differential) Powdered or Pre-poured Chromogenic agar Plate appearance Company 3M Food Safety Nissui, Oxoid Merck, BD, AES, BioMerieux Oxoid, BD, BioMerieux Time to Presumptive Result 40-48 hrs 72-96 hrs hrs Time to Confirmed Result from Presumptive 4 hrs 54 – 78 hrs hrs Validation AOAC – PTM, AOAC OMA, MicroVal Reference Method BD = AOAC; BioMerieux IBISA = AFNOR Method Limitations Aytpical lactose positive strains (S. arizonae and S. diarizonae) Brilliant Green agar = S. typhi and S. paratyphi S. typhi, S. paratyphi A, S. typhimurium, S. choleraesuis, S. minnesota, S. enterica subsp. arizonae, S. pullorum. S. Dublin may not grow for some media Level of detection Biochemical Confirmation Presumptive Positive; agar is used with one other media per reference method. Presumptive Positive Unique is the rapid disk based confirmation method. Competitors pick and use test tube or send out.

25 식품공전 Salmonella 25 g or 25 ml MacConkey DC XLD BS 24±2h / 35~37℃
펩톤수 24±2 h / 35~37℃ Ratio 1:100 Rapparport(1956) NA 0.1 ml TSI 사면배지 18~24 h / 35~37℃ 18~24 h / 35~37℃ 10 ml RV 배지 Gram stain (-) Urease (-) Lys decarboxylase (+) Etc. TECRA for Auto/manual identification Vassiliadis(1976) 43℃ → 42℃ 24±2h / 42±1℃

26 Biochemical Confirmation
디스크를 이용한 생화학적 확정방법은 타 생화학적 방법과 동일한 결과를 갖음. 비교 방법 TSI, 그램 염색 등 일반 생화학법 시험법 Vitek or API O&H 항형철형 시험법과 비교하지 않음

27 Items for consideration:
Some atypical, 유당 분해 양성 살모넬라 종은 다른 유당 분해 양성 미생물과 구별되지 않을 수 있음 (less than 1% of the total Salmonella serotypes). (S. arizonae and S. diarizonae)

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무균적으로 서플먼트를 개량한다 무균적으로 서플먼트를 베이스에 첨가함 샘플을 개량하여 멸균백 등에 넣는다 정량의 배지를 넣는다 다른 미생물 오염이 심할시 0.1ml 배양액을 10ml의 RVR10 배지로 옮긴다 18~24시간동안 41.5±1도에서 배양. 다른 미생물 오염 낮을때에는 9번으로 RVR10배지를18~24시간동안 41.5±1도에서 배양. 샘플을 적절히 교반한다 © 3M All Rights Reserved. Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M

29 Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M
피펫을 수직으로 세워 2ml의 희석액을 분주한다 사용전 8시간 까지는 20~25도의 상온에 보관이 가능. 희석액은 멸균수, 3차 증류수, 혹은 Butterfield’s Phosphate Diluent 등 공기방울이 생기지 않도록 상부필름을 조심스레 놓는다 누름판을 젤 가운데에 놓고 가볍게 누른다. 가로지르며 문지르지 않아야 함 20~25도의 상온에서 한시간 동안 평평한 수평면에 놓고 방치한다 © 3M All Rights Reserved. Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M

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배양액에 10ul loop를 담궈 루프끝에 액을 머금는다.(미생물오염도가 낮은 샘플) 배양액에 10ul loop를 담궈 루프끝에 액을 머금는다.(미생물오염도가 높은 샘플) 루프를 필름의 위쪽부터 대고 수평으로 지그재그를 그리며 한번 스트리킹한다. (싱글콜로니 얻기위함) © 3M All Rights Reserved. Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M

31 상부필름을 덮고 멸균장갑을 낀 손가락으로 위부터 아래로 살짝 문질러 면을 잘 닿게 하고 공기방울을 없앤다.
41.5±1에서 24±2시간동안 수평으로 배양. 20장 이상으로 쌓지 않는다) 배양 후 양성 추정 콜로니 위를 유성펜으로 표시간다. 표시된 콜로니를 모두 동정한다 (디스크 이용) © 3M All Rights Reserved.

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멸균장갑을 착용하고 상온의 컨펌디스크를 개봉하여 탭을 잡는다. 젤의 가운데에 공기방울이 들어가지 않도록 잘 놓는다. 상부필름을 덮는다 상부필름을 덮고 멸균장갑을 낀 손가락으로 위부터 아래로 살짝 문질러 디스크면을 잘 닿게 하고 공기방울을 없앤다. 41.5±1에서 4~5시간 동안 수평으로 배양. 배양 후 판독. 표시한 콜로니를 관찰한다. © 3M All Rights Reserved. Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M

33 Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M
살모넬라 콜로니 적색 콜로니에 황색존, 가스방울 혹은 모두 존재 디스크 반응 후 진한청색 콜로니, 혹은 붉은 가운데 진청색 침전물 Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M

34 Identifying Salmonella Species
The following are presumptive positive Salmonella species: Non- Salmonella species 푸른 콜로니, 녹색콜로니, 청록색 콜로니, 검정 콜로니 (황색존이나 가스방을이 있는 경우에도 추정콜로니 아님) 적색, 적갈색, 진적색 콜로니여도 황색존이나 가스방울없으면 추정콜로니 아님 적갯, 적갈색, 진적색 콜로니에 적색존이 있는경우도 추정콜로니 아님 Must circle presumptive positive Salmonella colonies prior to disking

35 Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M
황색존 없는 붉은 콜로니,붉은 갈색존의 붉은 콜로니 가스방울 없음 다른 미생물 콜로니 디스크 반응 후 붉은 콜로니색 그대로이고 진청색 침전물이 없음 붉은 콜로니, 황색존,버블 없음 청록색 콜로니에 가스 버블없음 © 3M All Rights Reserved. Confidential – Do not copy or distribute outside of 3M

36 Plate Sample

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