미생물 분자유전검사의 정도관리 : HCV PCR과 결핵균 PCR을 중심으로 서울대학교병원 주 세 익.

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1 미생물 분자유전검사의 정도관리 : HCV PCR과 결핵균 PCR을 중심으로 서울대학교병원 주 세 익

2 ? ? ? ? ? ? ? ? 검체접수 결과보고 검체보관 핵산추출 결과판독 검정 핵산보관 PCR 반응

3 국내정도관리결과 : 핵산추출법 표 1. 결핵균 DNA 추출과 HCV RNA 추출 나는 항상 핵산 추출에 성공하고 있는가?
1999년 2001년 참여(%) 오류 참여(%) 오류 DNA 추출법 38 기관 53 기관 Kit, diagnostic use 17(44.7) 1 26(49.1) Kit, research use 10(26.3) 14(26.4) 2 Home-made 11(28.9) 13(24.5) RNA 추출법 36 기관 41 기관 Kit, diagnostic use 14(38.9) 24(58.5) 2 Kit, research use 16(44.4) 2 14(34.1) 4 Home-made 6(16.7) 3( 7.3) 1 나는 항상 핵산 추출에 성공하고 있는가? 국내정도관리결과 : 핵산추출법

4 국내정도관리결과 : 검사방법 표 2. 결핵균 PCR과 HCV RT-PCR 결과 나는 항상 보고하는 결과를 확신하는가?
1999년 2001년 참여(%) 오류 참여(%) 오류 결핵균 PCR 37 기관 51 기관 Kit, diagnostic use 16(43.2) 1 25(49.0) Kit, research use 8(21.6) 18(35.3) 2 Home-made 13(35.1) 8(15.7) HCV RT-PCR 36 기관 41 기관 Kit, diagnostic use 14(38.9) 24(58.5) 2 Kit, research use 9(25.0) 1 11(26.8) 2 Home-made 13(36.1) 1 6(13.6) 3 나는 항상 보고하는 결과를 확신하는가? 국내정도관리결과 : 검사방법

5 검체처리과정의 의문과 확신 검체 운송상태가 결과에 얼마나 영향을 미칠까?  원내 운송의 경우는 실온 운반
퇴근시간인데 검체를 어떻게 보관해야 좋을까?  결핵균 검체는 냉장보관  HCV 검체는 혈장분리하여 0.1% sodium azide 첨가, 냉장 결핵균 집균을 가장 효율적으로 하려면?  1% DTT로 동량 첨가하여 37ºC에 10분, 원심분리 HCV 검체로 혈청검체는 좋은가?  혈장 검체보다 HCV가 감소함. 검체처리과정의 의문과 확신

6 핵산추출과정의 의문과 확신 핵산추출의 성공여부를 즉시 알 수 있을까?
 결핵균 검체에는 반드시 환자 자신의 세포가 있음 : 전기영동  HCV 검체에 carrier DNA(RNA)을 일정량 첨가하여 핵산 추출 후 spectrophotometer로 정량 : 회수율 평가 핵산을 어떻게 보관해야 좋을까?  DNA는 1x TE에 녹여 냉장보관, -70ºC에 보관  RNA는 RNA침전물의 단계에서 75% EtOH-1 mM EDTA에 녹여서 -70ºC에 보관. Column 법으로 추출할 경우는 Rnase-free water로 녹여 -70ºC에 보관. 핵산추출과정의 의문과 확신

7 PCR 과정의 이해 : temperature cycle
2~5 cycles 25~30 cycles 95ºC 95ºC 95ºC 5 min 1 min 30 sec 90 72ºC 72ºC 72ºC 1 min 30 sec 5 min 70 55ºC 55ºC 50 1 min 30 sec 30 Initial denaturation Final extension PCR 과정의 이해 : temperature cycle

8 PCR 과정의 이해 : 반응액 내의 분자들 PCR반응의 구성 성분 일반적 시약 농도 혼합액 조성 시 사용량
일반적 시약 농도 혼합액 조성 시 사용량 PCR 반응액 내 최종 분자수 DNA template 100 ng/l 3-5 l 105~106 분자수 Taq DNA pol 5 U/l 0.1~0.3 l 1010~1011 분자수 Primers 10~20 pmol/l 1~2 l 1012~1013 분자수 Mg+2 25 mM 1~4 l 1015 분자수 dNTPs 10 mM 1~2 l 1015~1016 분자수 PCR products 1011~1012 분자수 PCR 과정의 이해 : 반응액 내의 분자들

9 PCR 과정의 이해 : 증폭산물의 증가 Plateau phase Exponential amp. phase
6 5 Exponential amp. phase 4 3 2 Initiation phase 10 20 30 반응회수 PCR 과정의 이해 : 증폭산물의 증가

10 ? PCR 산물의 분석(1) : 양성? 음성? (어떤 검사실의 DNA PCR 증폭산물의 전기영동)

11 ? 결과에 확신을 가질 수 있는 방법은 없을까?  최저 예민도를 표현할 수 있는 CONTROL을 사용
PCR 산물의 분석(2) : 양성? 음성?

12 PCR 산물의 분석(3) : 반응의 동일성 확인 (강남성모병원의 결핵균 PCR 자료 인용)
Internal control을 사용하여 각 반응의 동일성을 확인하다 ! (강남성모병원의 결핵균 PCR 자료 인용) PCR 산물의 분석(3) : 반응의 동일성 확인

13 PCR 산물의 검증(1) : 제한효소처리 증폭산물의 내부에 존재하는 제한효소로 처리하여 확인
비특이적인 bands는 아니겠지? (size가 같은 것 같아…) 증폭산물의 내부에 존재하는 제한효소로 처리하여 확인 PCR 산물의 검증(1) : 제한효소처리

14 PCR 산물의 검증(2) : Hybridization
증폭산물의 내부에 결합하는 probe로 확인 PCR 산물의 검증(2) : Hybridization

15 숙련도가 중요하다. 결론(1) : 숙련되어야 한다. 그림 1. 양성대조검체의 연도별 흡광도 변화 (서울대병원) CV(%)
검사회수 60 65 50 60 47.3% 61 59 40 54 28.2% 40 30 25.3% 22.7% 20 20 10 숙련도가 중요하다. 결론(1) : 숙련되어야 한다.

16 각 검사법의 예민도를 측정하여야 한다. 결론(2) : 최저 측정지의 양성대조를 사용
 결핵균 집락 10개에 대한 계단희석 검체를 이용한 검사  HCV Ab(+) fool serum의 계단희석 검체를 이용한 검사  반드시 10회 이상 반복검사에서 항상 양성을 확인할 수 있는 최대 희석검체를 양성 대조검체로 사용한다. 결론(2) : 최저 측정지의 양성대조를 사용

17 가능한 internal control을 사용한다
 핵산 추출의 실패를 확인할 수 있다.  PCR 반응의 성공여부를 확인할 수 있다. 증폭산물의 검증은 필수  제한효소로 소화되는지 확인한다.  Hybridization을 실시한다. 결론(3)

18 분자유전검사 키트의 유효성 평가기준 마련 새로이 개발되는 국내 바이오 벤처사의 제품들이
진단 유효성에 대한 제대로 된 평가 없이 임상에 적용되고 있음. 이들에 대한 유효성 평가 기준을 마련하는 것이 시급함.