A novel method for synthesizing PEGylated chitosan nanoparticles:

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1 A novel method for synthesizing PEGylated chitosan nanoparticles:
strategy, preparation, and in vitro analysis 나노식품가공학 곽 병 만 / 김 민 식

2 Contents 1. Introduction 2. Materials and Methods 3. Results
4. Discussion 5. Conculsion

3 Introduction 키토산 단위 구조 β-(1–4)-2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose 키토산의 특징
polycationic, nontoxic, biodegradable, biocompatible polymer 키토산의 활용범위 생명공학, 제약, 섬유, 식품, 화장품, 농업 산업 등에 적용 키토산 최근 연구 신약, 유전자, 펩타이드, 백신 전달물질, 타겟 물질의 전달과 조직공학 적용 키토산의 1차 아미노산 그룹의 반복적인 존재 - 키틴과 세룰로오스와 비교되어 많은 연구가 진행됨 - cell transfectant의 키토산 생성 - 효과적인 운반체인 세포의 endosome 생산을 위한 세포내 산성 pH에 대응하는 폴리머의 팽창특성과 관련된 “proton sponge" 효과를 나타낸다.

4 Introduction - 키토산 유도체는 1차 아민 그룹을 변경하면서 합성 키토산의 효과적인 활용을 제한하는 주요 단점
- 아민 그룹(양성자 수용) 존재 - 산성용액에 녹고 다른 유기용매에는 잘 녹지 않음 유전자 전달 및 생물학적 활용 등 키토산의 효과적인 활용 촉진 - 물 또는 유기 용매의 용해성 필요 - 1차 아민 그룹을 변경하면서 poly ethylene glycol(PEG) 와 같은 다른 중합체에 화학 변화를 통하여 공중합체 생산 - 고유 특성인 분자 구조와 길이를 유지하면서 다양한 반응적용 - 아민 그룹의 화학적 변경은 고유 물리화학 및 생화학적 활성을 잃음 : 키토산 기본 골격에 변화를 발생시키기도 함.

5 Introduction 키토산의 hydroxyl groups의 변경
- 구조적 특성과 기능적 특징에 영향을 주지 않음 : 그 중요성이 대두됨. - OH groups 변경의 키토산 PEGylation은 Gorochovceva와 Makuska이 제안 Poly Ethylene Glycol (PEG) - Graft-forming polymer로 광범위하게 사용되고 있음. - 물과 유기 용매에 용해 - 무독성, 항원성 및 면역반응을 자극하는 특성이 없음. - 생분해성 및 생물학적 적합성. - Crosslinker와 약물을 배출할 수 있는 물질의 graft polymer로 사용 키토산 나노입자 합성 - polymer 또는 crosslinker의 농도, 키토산의 분자량, pH 및 안정제 약물/유전자 : polymer의 비율, 계면활성제등을 변경하여 합성함 - 키토산 나노입자의 구조와 형태학적 특성 및 약물의 배출 속도에 영향을 줌

6 Introduction 연구의 목적 - 키토산의 hydroxyl group에 PEG의 화학적 선택 결합을 쉽게 하는 것
- 키토산의 아민 그룹을 phthalic anhydride를 사용하여 최초로 보호하는 것 기존 연구 - Nanopartilces는 ionic gelation method를 사용하여 제조 - polymer와 crosslinker의 농도 비율, 용액의 pH 이전 연구를 참조하여 조정함. 현재 연구 방향 - 효율적인 유전자/약물 전달을 목적 - PEG-grafted chitosan nanoparticles의 제조방법의 개발

7 Materials and methods Low-molecular-weight chitosan
(viscosity of 5~20 cP / degree of deacetylation of 80.0%) Wako (Richmond, VA, USA), Poly (ethylene glycol) monomethyl ether (MW 5000) / pyridine, phthalic anhydride / sodium hydride (NaH) / glacial acetic acid hydrazine monohydrate / sodium tripolyphosphate (TPP) agarose (low gelling temperature) / ETBr (10 mg/mL) Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). Anhydrous tetrahydrofuran (THF), anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF), sodium hydroxide (NaOH) / methanol Thermo Fisher Scientific (Ottawa, ON, Canada). Thionyl chloride (SOCl2) VWR (Mississauga, ON, Canada). ultra pure doubledistilled water (ddH2O) Barnstead Nanopure diamond siGLO (Green) transfection indicator (20 nmole) Dharmacon (Lafayette, IN, USA). CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent Promega (Madison, WI, USA) TrackIt 10 bp DNA ladder (0.5 μg/μL) Invitrogen (Burlington, ON, Canada) Neuro2a cell line / Eagle’s minimum essential medium (EMEM) Cedarlane (Burlington, ON, Canada) 10% fetal bovine serum (FBS)

8 Deacetylation of chitosan Phthaloylation of chitosan
Materials and methods Deacetylation of chitosan Commercially available low-molecular-weight chitosan (5 g) ↓ added to a 40% (w/v) aqueous NaOH solution. Mix ↓ for 4 hours at 110°C under a nitrogen atmosphere. Vacuum filtered, pulverized, and was again treated with ↓ 40% (w/v) NaOH under similar conditions The resultant product (b) in Figure 1 was freeze-dried. Phthaloylation of chitosan Deacetylated chitosan (1.00 g) ↓ added to a solution of phthalic anhydride (2.76 g) in 20 mL of DMF. Mix ↓ for 8 hours at 120°C under a nitrogen atmosphere. The resultant product (c) in Figure 1 ↓ cooled to room temperature and precipitated in ice cold water. The precipitate was filtered, washed with methanol overnight ↓ Vacuum dried.

9 Materials and methods PEGylate chitosan chemoselectively
The synthesis was accomplished in 3 steps: 1) chlorination of chitosan, 2) activation of OH- PEG-OCH3(mPEG) with NaH 3) grafting activated mPEG onto chlorinated chitosan. phthaloylated chitosan (0.1 g) + 20 mL of pyridine + SOCl2 ↓ 80°C for 30 minutes, nitrogen atmosphere.   Cooled, filtered, vacuum dried. ↓ yield chlorinated-phthaloyl chitosan ↓ 4 g of OH-PEG-OCH3 (mPEG) ↓ NaH (10 mg) in 50 mL of anhydrous THF ↓ 60°C, 2 hours, nitrogen atmosphere.   ↓ chlorinated-phthaloyl chitosan (60 mg) ↓ 16 hours under similar conditions. ↓ Cool, precipitated in methanol, filtered, vacuum dried PEGylate chitosan

10 Materials and methods Deprotection of PEGylated-phthaloyl chitosan
PEGylated-phthaloyl chitosan (100 mg) Hydrazine monohydrate (15 mL) Distilled water (30 mL) ↓ mixed and heated at 100°C for 16 hours under constant magnetic stirring. Evaporate ↓ Until a viscous solution was left. ↓ Excess hydrazine monohydrate was removed ↓ The process was repeated 3 times ↓ Reconstituting the mix with distilled water each time ↓ Until a solid residue was left. Dried under vacuum ↓ PEGylated chitosan.

11 Materials and methods Preparation of PEGylated chitosan nanoparticles
After the deprotection of PEGylated-phthaloyl chitosan ↓ Dissolved (yield a concentration of 0.5 mg/mL) ↓ 1% (v/v) acetic acid solution, pH 5. Dissolved (TPP, in ddH2O) ↓ concentration of 0.7 mg/mL, pH 3. Nanoparticles ↓formed after the addition of TPP (drop-wise) ↓ under constant magnetic stirring for 1 hour at room temperature. Analysis (TEM for their morphology and size. )

12 Materials and methods Phthaloyl chitosan Chitosan
Deacetylated chitosan PEGylated phthaloyl chitosan Chlorinated phthaloyl chitosan intermediate PEGylated chitosan.

13 Materials and methods Gene loading efficiency by the gel retardation assay 4% w/v agarose gel ↓ for 4 hours at 55 V ↓ Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer (pH 8.3). ↓ TBE buffer (0.5 μg/mL의 ETBr 함유) Analysis UV transilluminator RNA bands 측정 (365 nm, ChemiDoc™ XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA)) ●  The encapsulation/gene loading efficiency of PEGylated chitosan polymer - siGLO의 복합체, transfection indicator, 나노입자 형태 결정 ● PBS내의 free siGLO과 나노입자의 siGLO complexed 확인 - Electrophoresis ● 나노입자의 siGLO complexation - 사전연구에서 결정된 200:1 (polymer:gene, w/w)로 수행

14 Materials and methods Transfection assay Incubation
↓37°C, 5% CO2 for 4 hours Analysis (Fluorescence microscope (Nikon Eclipse TE2000-U) at 490 nm) Cytotoxicity assay Cell-Titer 96 AQueous One Solution Reagent (MTS assay) 사용 ↓ 제조업체 실험절차에 따라 4시간 배양. 4시간 추가 배양 ↓ Analysis microtiter plate reader (Perkin Elmer 1420 Multilabel Counter Victor 3TM V) 490 nm에서 MTS assay 실시(세포 실험은 3반복 수행함) 비고 Mouse neuroblastoma 세포 (Neuro2a)는 complete growth media의 well 당 20,000 cells로 96-well plate에 접종하여 transfection 연구는 접종 24시간 후에 수행함. Tested samples Control sample chitosan–TPP nanoparticlesfree siGLO Treatment samples chitosan–TPP:siGLO nanoparticles PEGylated chitosan–TPP:siGLO nanoparticles(200:1 w/w)

15 Materials and methods Statistical analysis
PEGylated 키토산-TPP nanoparticles 와 키토산-TPP의 nanoparticles의 값을 비교 Values : means ± standard deviations (SD). The statistical significance : independent t-test (P values : 95 % 신뢰수준) Statistical analysis : Minitab

16 Results Deacetylation of chitosan
13C nuclear magnetic resonance (NMR)로 상용화 되는 키토산으로 확인 acetyl peak (-CH3) : ppm carbonyl peak (−C=O) : ppm이 없음으로 확인함 TOSS mode 확인 (δC) commercially available chitosan 23.88 (CH3) 59.01 (C-2) 61.76 (C-6) 75.64 (C-5, 3) 82.51 (C-4) 105.68 (C-1) 175.04 (C=O) deacetylated chitosan - 60.76 (C-2, 6) 75.84 (C-4, 5, 3) 102.80

17 Results Phthaloylation of chitosan (phthaloylated chitosan confirm (13C NMR)) TOSS mode Phth phenylene Phth C=O ppm ppm TOSDL mode Phth C-1,2 ppm ppm NMR (δC ppm) 58.19 (C-2), (C-6), 72.44 (C-3), (C-5), 83.91 (C-4), (C-1), 124.62, , 169.66  131.63  169.89  FTIR (νmax/cm−1) Commercially  chitosan 1630 (amide I), 1542 (amide II), and 1024 (pyranose). Phthaloylated  3200–400 (OH), 1774 (imide C=O), 1710 (imide C=O), 1150–000 (pyranose), and 720 (arom)

18 Results Synthesis of PEGylated chitosan. FTIR (νmax/cm−1)
PEGylated chitosan (2D) 2871 (C-H stretching), 1066 (C-O stretching), 1290, 1251, 950 and 837 PEG5000 substitution (2C) 2878 (C-H stretching), 1100 (C-O stretching), 1466, and 1278. Deprotection of PEGylated-phthaloyl chitosan. FTIR (νmax/cm−1) deprotected PEGylated chitosan (2E) PEG : 2878 (C-H stretching) 1066 (C-O stretching) Chitosna : 1633 (amide I) 1582 (amide II) 1024 (pyranose) disappearance of phthaloyl group　 : 1774 (imide C=O) 1710 (imide C=O)

19 Results PEG-grafted chitosan: disappearance of peaks 1774 cm−1 and 1702 cm−1. 6-O-PEG-g-2-N-phthaloyl chitosan OH-PEG-OCH3, M.W. 5,000 Phthaloylated chitosan OH groups of phthaloylated chitosan deacetylated chitosan

20 Preparation of PEGylated chitosan nanoparticles
Results Preparation of PEGylated chitosan nanoparticles Deprotected PEGylated chitosan polymer : TPP의 음이온 전하와 chitosan 1차 아민 그룹의 양이온 전하 사이의 정전기적 상호 작용에 의해 crosslink 되어있음. Crosslinking 형성 결과의 TEM 측정 : transmission electron microscopy 100~150 nm 3A : PEGylated chitosan polymer (57000X), 3B : Chitosan-TPP nanoparticales (22000X 배율) 3C와 3D : PEGylated chitosan-TPP nanoparticles을 57000X 배율과 135000X 배율로 측정한 결과 PEGylation은 nanoparticles이 구형 형태로 얻어졌음.

21 Results Gene loading efficiency of PEGylated chitosan nanoparticles.
PEGylated chitosan-TPP nanoparticles와 siGLO의 complexation 평가 - 표준물질 10 bp DNA ladder - 겔 지연 분석 - control sample : PBS + free siGLO 6 ug/mL - treatment sample : PEGylated chitosan-TPP NPs complexing siGLO (200:1, w/w) UV transilluminator 측정 - control sample(free siGLO 함유) : 현탁액에서 결합되지 않은 siGLO 밴드 확인 : PEGylated chitosan nanoparticles와 siGLO가 결합되어 밴드가 없음

22 Results Transfection efficiency and cell viability assay
siGLO-loaded nanoparticles의 형광 광도로 측정. siGLO : transfection indicator이며, 포유 동물 세포실험의 핵심적인 형광발색 oligonucleotide

23 Results Transfection efficiency and cell viability assay
PEGylated chitosan–TPP:siGLO nanoparticles ; increase in cell viability (≈.70%) (compared with the chitosan–TPP:siGLO nanoparticles (≈.20%)) independent t-test, P , 0.05

24 Discussion A : acetylated 된 키토산 B : deacetylated 된 키토산
(40%(w/v) NaOH용액에 2회 처리) C : N-phthaloyl 키토산 (DMF/Water(95/5 v/v) 사용) 유기용매에 키토산이 용해성을 가지기 위해 phthaloyl 그룹(1774cm-1), carbonyl 그룹(1704cm-1)에서 확인 D : chlorinated phthaloyl 키토산 OH 그룹이 chlorine 그룹으로 대체되어 3200cm-1~3500cm-1의 OH 피크 소실 E : mPEG(OH-PEG-OCH3)는 THF의 NaH에 의해 활성화되어 chlorinated phthaloyl 키토산은 PEG-융합 phthaloyl 키토산 형태로 중합 F : 최종 생산물(PEG-융합 키토산) 1774cm-1, 1710cm-1 피크 부재로 phthalimido 그룹 완전 분리 확인

25 A : deacetylated 된 키토산 B : phthaloylated 키토산 (1774cm-1 : phthaloyl 그룹 1702cm-1 : carbonyl 그룹) 3200cm-1~3500cm-1의 OH그룹 존재 C : OH-PEG-OCH3(MW 5,000) D : PEG 융합 phthaloyl 키토산 (PEG의 존재는 2871cm-1 피크로 확인) E : 최종 생산물(PEG-grafted 키토산) (1774cm-1, 1702cm-1 피크 없음 1633cm-1(amide1), 1582cm-1(amide2)은 키토산의 primary amine그룹 존재) OH그룹

26 PEGylated 키토산을 생산하기 위해 NaH를 촉매제로 사용하여 알칼리 반응조건을 만듬
NaH, PEG, 키토산의 정확한 비율에서 반응조건이 가장 좋으며 이 연구에서는 NaH:PEG:키토산 질량비 2:4:1을 사용하였고, 총 반응시간은 18~20시간 가량 소요 키토산 나노입자는 키토산 polymer와 polyanion TPP의 2개액상 혼합물이 ionic gelation에 의해 만들어질 수 있음 키토산의 amino 그룹은 TPP와 coacervate를 이루어 대략 100nm의 크기가 되며 이번 연구에서는 siGLO와 siRNA를 PEGylated 키토산과 혼합하여 나노물질을 제조하였으며 gel retardation 연구와 neuronal cell line의 나노입자/운반체의 transfection으로 측정

27 neuronal cell에서 siGLO 복합체가 운반체로서의 역할을 하고 있음
나노입자가 cell에 주는 영향을 확인하기 위하여 cell viability assay 수행하였으며 키토산 나노입자 단독 cell transfection으로 확인 나노입자의 positive charge가 cell membrane에 작용하더라도 primary amino 그룹이 transfection에 관여하는 것을 확인할 수 있으며, PEG는 입체적 방해를 줄이며 나노입자를 더욱 hydrophilic하게 함

28 세포독성은 키토산 나노입자와 siGLO 복합체가 키토산 단독보다는 강함
siGLO 복합체 형성 후 나노입자의 크기가 감소되어 cell membrane과 분자간 상호작용이 활발해지고 표면적이 증가됨에 따라 발생으로 보여짐

29 Conclusion 촉매제로 NaH를 사용하여 PEG alkoxide를 형성하여 키토산 polymer에 PEG를 결합을 유도
PEGylated 키토산은 물과 다른 유기용매에 쉽게 용해됨 결합을 유도하는 과정은 쉽고, 짧은 시간에 원하는 제품을 얻을 수 있음 또한 키토산 분자에는 영향을 미치지 않음 PEGylated 키토산 나노분자는 siGLO와 복합체를 형성하고 최소한의 세포독성을 보임 (키토산 단독보다 낮은 수준임)

30 감사합니다

31 키틴 : NHCOCH3 키토산 : NH2 셀룰로오스 : OH