Semen Analysis Sperm Preparation (IUI)

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1 Semen Analysis Sperm Preparation (IUI)
IUI: intrauterine insemination

2 Semen Analysis

3 남성 불임증을 진단하는 가장 중요한 기본검사이며, 비교적 용이하게 시행할 수 있다는 장점을 가지고 있으나, 정액 검사시 10-15%의 피할 수 없는 오류가 발생한다. 그러므로 검사실마다 정액채취법, 금욕기간, 정액검사법 및 검사의 기준치를 표준화 시킬 필요가 있다. 정액검사는 정액의 색깔, 냄새, 양, 점조도, 정자수, 운동성 정자의 비율, 운동성 양상, 정자형태 등에 대한 분석을 주관적으로 시행하고 있다. Computerized Sperm Analzer보다는 숙련된 육안적인 관찰이 정자수, 운동성 정자의 비율, 정자의 운동속도 및 정자형태 등에 대한 분석에 객관적이다. 정자는 약70일전부터 고환에서 만들어져 약 15일간 부고환과 정관을 거치면서 운동성도 활발해 집니다.

4 금욕 기간 금욕 기간은 정액 검사 결과에 중요한 영향을 끼친다.
Levin등(1986)은 매일 연속으로 정액을 채취하여 정자 수와 정액 량을 측정한 결과, 정자 수와 정액 량이 첫 4일간 70%씩 감소됨을 보고하였다. 정액 변수는 금욕 후 1일에서 5일까지 점차 증가하며, 금욕 후 1일 평균 정자수는 1ml당 천오백만, 정액량은 0.5ml 씩 증가한다(Schwartz et al. , 1979). 반대로 금욕 기간이 길어졌을 경우, 죽은 정자와 기형 정자의 수가 증가되므로 사출정액의 질을 떨어뜨리게 된다. 금욕 기간은 2-3일이 적당하며, 이 간격으로 정액을 채취할 경우 사출당 정액 변수의 변이를 최소화 할 수 있다. 따라서 검사실 마다 금욕 기간은 분명히 기록되어야 한다.

5 정액채취법 정액 채취 방법에는 수음(maturbation)과 성교중단법(coitus interruptus)이 있으며 손으로 수음을 시켜서 채취하는 것이 좋다 . 이것이 불가능할 때는 성교 중단법(질외사정법)으로 채취하여 1시간 이내에 검사실까지 가져오게 하는 것이 바람직하다. 정자는 온도에 민감하므로 수송시 각별한 주의가 필요하며, 적정 온도는 20-25℃이다. 성교 중단법은 사출시 정액의 첫부분을 손실할 가능성이 높으며. 정액내의 질의 상피세포가 출현할 가능성이 높다. 수음 및 성교중단법에 의해서 채취가 불가능한 병적 소견을 보이는 환자에서는 전립선 마사지법 및 전기사정법(electro - ejaculation)이 이용되기도 한다.

6 채취 용기 정액을 채취하는 용기로는 입이 넓고 눈금이 그려져 있는 유리로 만든 용기가 적당하나, 깨지기가 쉽고 값이 비싸다는 단점이 있어 최근에는 일회용 plastic 용기를 선호하고 있다. 될수 있으면 입이 넓으며 뚜껑을 닫을 수 있는 120ml polypropylene 용기를 권장. Check 등(1988)에 의하면 polystyrene과 같은 plastic으로 만든 용기는 정액의 점조도를 증가시키고, 정자에 유해한 영향을 끼치며, 정자의 운동성을 감소시킨다고 보고함으로써 채취 용기의 중요성을 강조하였다. 미국에는 수음을 거부하는 환자들의 정액 채취를 위하여 특별히 고안된 condom 이 있는데 성교시에 이것을 착용한 상태에서 정액을 채취하여 수음에 비해 질이 좋은 정액을 얻을 수 있다고 보고하였으나 (Zavos, 1985), 흔히 피임으로 사용하는 condom 은 정자를 죽이는 살정제가 있기 때문에 절대로 사용해서는 안된다.

7 수송 정액은 정액 검사를 시행할 수 있는 검사실 가까이 에서 채취되는 것이 바람직하다.
즉 수송 시간이 짧을수록 정액 검사자가 채취 직후의 정액에서부터 액화 과정을 잘 관찰할 수 있으며, 수송시 정액이 노출될 수 있는 극심한 온도 변화를 최소화 할 수 있다. 그러므로 검사실 가까이 조용하고, 깨끗하며, 격리된 전용 공간을 마련하는 것이 바람직하며, 방안에는 도움을 줄 수 있는 잡지나 video를 구비해 둔다. 일부 병원에서는 부부가 같이 정액을 채취할 수 있는 정액채취실을 가지고 있기도 하다. 이렇게 잘 설치된 방에서도 정액 채취가 불가능한 환자는 집이나 그밖에 환자가 편안히 생각할 수 있는 장소에서 정액을 채취하게 하며 채취 후 1시간 이내에는 검사실까지 가져오게 한다. 병원 밖에서 정액을 채취 할 때는 정액 채취 및 수송에 관하여 세심한 주의를 가질 수 있도록 환자를 잘 교육시켜야 한다.

8 1) General Principles (1) 정액 채취 ① 일반적으로 3일간의 금욕기간이 필요하다.
② 멸균 용기에 masturbation에 의해 정액을 채취한다. ③ 정액은 채취 후 1시간 내에 검사를 실시해야 한다. (2) 액화 (Liquefaction) ① 실온 또는 37℃ warm plate에서 정액을 액화시킨다. ② 정상적인 정액의 경우에는 실온에서도 20∼30분내에 액화된다. ③ 만약 정액이 액화되지 않았다면- 몇 분 동안 더 둔다. * 주의: seminal plasma에 오랫동안 spermatozoa가 노출될 경우 functional capacity가 영구적으로 감소할 수 있다.

9 - 물리적 방법을 사용한다. ⅰ. pipetting ⅱ. needle technique (syringe로 풀어준다) * 주의: 운동성 감소의 원인이 된다. - 화학적 방법을 사용한다. ⅰ. EDTA 처리 ⅱ. human serum을 섞어 단백질 분해효소에 의하여 액화 (3) 혼합 (Mixing) ① 액화된 정액을 멸균 용기 내에서 20∼30초 동안 골고루 잘 섞어준다. * 주의: vortex mixing은 안됨

10 2) Physical Characteristics
(1) Appearance ① 정액의 색, 불투명/반투명, mucus 또는 cell clumps의 존재를 관찰한다. ② 사람의 정액은 정상적으로 grayish-yellow opalescent fluid이다. ③ urine contamination 정액 - 정상 정액보다 더 yellow color로 변색된다. - uriniferous 냄새가 난다. - viscosity 감소로 쉽게 확인할 수 있다. ④ blood contamination 정액 - fresh blood color 정액: pink 또는 reddish color로 변색된다. - old blood color 정액: brown color로 변색된다. (2) 냄새 (Odor) ① 정액의 냄새는 사람에 따라 다르다. - 정상 정액의 경우에도 냄새가 없거나 또는 강하게 나타날 수 있다. ② 정액의 냄새는 일상적인 정액 검사에서는 거의 하지 않으나 urine 또는 부패 냄새가 강할 경우에는 기록을 해둔다.

11 (3) 정액의 양 ① 15㎖ conical tube에 모아서 측정한다. ② 정상적인 정액의 양: 2∼6㎖ (4) pH ① 액화된 정액의 pH는 test strips을 사용하여 측정한다. ② 정상적인 정액의 pH: 7.2∼8.2

12 3) Routine Semen Analysis
(1) Sperm Concentration ① Makler counting chamber를 사용하여 정자수를 센다. ② [100개의 격자 중에서 총 30개 (가로 10개+세로 10개+대각선 10개)의 격자 내에 있는 모든 정자의 수를 세어 3으로 나눈 값] × 10(6)/㎖ ③ 정상적인 정자의 수: 20∼200 × 10(6)/㎖ * 정자의 수가 20 × 10(6)/㎖ 미만의 경우: oligozoospermia (2) Sperm Motility ① immotile 정자와 motile 정자의 수를 세어 결정한다. ② 운동성 (motility, %) = {(immotile sperm 수 / total sperm 수) × 100 } ③ 정상적인 정액은 최소한 50% 이상의 운동성 정자가 존재할 경우이며, 이들의 motile pattern은 직진 운동을 해야한다. * 정자의 운동성이 40% 미만의 경우: athenozoospermia ④ progressive rate (%) = (progressive motile sperm 수 / motile sperm 수) × 100

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14 (3) Sperm Agglutination & Aggregation
- antibody에 의해 정자가 서로 붙어 있는 것으로 대부분 motile하고 주위에 다른 cells 또는debris가 적다. - 대부분 head-to-head, midpiece-to-midpiece, tail-to-tail과 같이 specific한 형태로 발생한다. ② Aggregation - 정자와 다른 cells 또는 debris들이 clumps를 이루고 있다. - aggregation된 정자는 대부분 죽어있다.

15 (4) Other Cellular Component & Debris
① Leukocytes (White Blood Cells, WBC) - 정자의 머리보다 크기가 더 크다. cf) 정자의 머리보다 크기가 더 작은 것은 debris이다. - 1× 10(6) /㎖ 미만일 경우 정상, 그 이상일 경우 수정이 잘 안된다. ② Erythrocytes (Red Blood Cells, RBC) - 정액 내에 RBC가 존재할 경우 정액의 색이 붉게 나타난다. - 정액에 RBC가 존재할 경우 비정상이다. ③ Particulate debris - 정자의 머리보다 크기가 더 작은 anucleate cytoplasmic mass들을 말한다. - 정상적인 정액에서도 관찰된다. - bacterial infection과의 구분이 중요하다. ④ Bacteria & Protozoa - 일반적으로 사람의 정액에는 존재하지 않는다. - bacteria와 protozoa의 존재는 male genital tract의 감염과 관계가 있다. - bacteria가 들어있는 정액은 microbiological 분석을 해야한다.

16 정자 기능 검사 (Tests of Sperm Function)
(1) Sperm Penetration Assay (SPA) SPA는 배우자의 정자와 투명대를 제거한 햄스터 난자를 함께 배양시켜 정자의 침투능력을 측정하는 방법으로 정상적인 임신능력을 가진 정자의 경우 약 15% 정도의 침투 능력이 있는 것으로 측정된다. SPA는 정자의 수정 능력과 임신 가능성을 정액검사나 성교 후 검사보다 더욱 정확히 판단할 수 있는 유용한 검사이나 다른 검사에 비해 많은 시간이 소요되고 비용이 많이 드는 복잡한 검사이기 때문에 일부 불임병원에서만 시행되고 있다. (2) In Vitro Tests of Sperm Penetration into Mucus 이 검사는 성교 후 검사의 결과가 불량한 불임 부부에게 특히 유용한 검사로 배우자의 장자를 bovine mucus에 침투시켜 정자의 문제인지 자궁경관점액의 문제인지를 구별하는 방법이다.

17 항정자 항체 검사 (Antisperm Antibody Test)
정자는 매우 antigenic 하지만 정상에서는 혈관고환 방어막(Bloodtestis barrier)에 의해 인체의 면역 기전으로부터 격리 보호되고 있다. 그러나 정관의 감염이나 수술, 고환 손상 등으로 이 방어막이 깨어질 경우 항정자 항체가 형성된다. 여성에서도 여러 남성과 성 접촉을 하거나 성기 감염이 있었던 경우 항체가 형성되어, 성관계 후 질 가려움증을 느끼거나 심한 경우 심혈관계허탈(cardiovascular collaps)까지, 여러 증상을 발현시키기도 한다. 항정자항체 검사는 정자에 대한 항체 반응을 측정하는 것으로 크게 두 가지 방법으로 검사가 가능하다. Mixed agglutination test(SpermMar)는 IgG에 대한 항혈청을 이용하여 antibody-coated sperm과 latex particle의 결합을 관찰하는 검사이며, Immunobead Test는 anti-IgG, anti-IgM등으로 각기 label된 beads를 이용하여 항정자 항체의 종류를 규명하는 검사이다. SpermMar test는 처리되지 않은 정자 그대로 검사가 가능하나 Immunobead test는 sperm washing이 필요하기 때문에, 외래 진료의 선별검사로는 SpermMar test가 적당하다. 우선 SpermMar test로 항체의 유무를 확인한 후, 양성인 경우 항체의 종류와 작용 위치를 판단하기 위하여 Immunobead test를 시행하는 것이 바람직하다.

18 정자수 계산 Neubauer - chamber 법
(1) WBC pipette를 이용할 경우, 정액을 0.5 눈금까지 흡인한 후 증류수나 0.3%식염수를 11눈금까지 흡입한다. (2) Micropipette를 이용할 경우, 0.1ml의 정액을 증류수나 0.3% 식염수에 섞는다. * 정자 수가 HPF 당 10개 미만일 경우 1:10으로 희석한다. 1. WBC pipette를 이용할 경우, 정액을 1.0 눈금까지 흡인한 후 증류수나 0.3%식염수를 11눈금까지 흡입한다. 2 . Micropipette를 이용할 경우, 0.1ml의 정액을 0.9ml의 증류수나 0.3% 식염수에 섞는다. 3. 잘 희석한다. 4. pipette으로부터 몇 방울은 버린다 5. Chamber 의 양쪽 홈위에 cover glass를 덮은 후 희석된 정액 10μl를 홈에 살며시 채운다. 2-3분간 방치하여 정자가 부유하게 한다. 6. 현미경 하에서 정자를 세는데 편의상 25개의 정사각형을 전부 세지 않고 그림과 같이 구석4개와 중앙의 1개, 계 5개의 칸만 세어 계산한다. 7. Chamber의 양쪽의 정자를 계산한 후 평균치를 구한다. 8. 1ml당 총정자수를 계산한다. 정액을 1:20으로 희석했을 경우 5칸의 정자 수에 106을 곱해 주면 1ml당 정자 수를 산출할 수 있다. (5칸의 정자 수가 80개 였다면 이 정액의 정자 수는 80 x 106/ml이다) 정액을 1:10으로 희석했을 경우 5칸의 정자 수에 0.5를 곱한 후 106을 곱해 주면 1ml당 정자 수를 산출할 수 있다(5칸의 정자 수가 80개 였다면 이 정액의 정자 수는 80 x 0.5 x 106 = 40 x 106/ml 이다) 계산: a ∼ e 의 5구획의 정자수 x 106 = 정자수 106 = 1/5 mm2 내의 정자수 x 10 ( chamber의 깊이) x 20 (희석배수) x 103 정자농도: 정액 1cc 중의 정자수 총정자수 : 정자농도 x 정액량 정자 농도 정상치: x106/ml

19 Neubauer - chamber

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21 Makler chamber 방법 Makler chamber 방법

22 1. chamber를 붓을 이용하여 물로 잘 세척한 후 완전히 말린다.
2. 정액을 잘 혼합한 후 chamber의 기저부 중앙에 10μl의 정액을 올려놓는다. 3. CHAMBER의 윗부분을 기저부에 살며시 올려놓는다. 4. CHAMBER의 손잡이 면을 손으로 잡아 현미경 위에 올려놓은 후 200배로 관찰한다. 5. 10칸의 총정자수를 계산한다. 6. 10칸의 총정자수에 10(6)을 곱해 주면 1ml당 정자 수를 산출할 수 있다. 7. 5의 과정을 한번 더 반복한다. 7. 5,7 결과의 평균값을 계산한다.

23 기형정자증( teratozoospermia)
신체적 상태가 양호하지 못할 때 (debilitating illness), Virus에 의한 감염, 정맥 정계류(varicocele), 방사선(radiation)에의 노출, 고환이 독성 물질에 노출되었을 때 및 스트레스에 노출되었을 때 기형 정자가 증가한다. 스트레스는 뾰족형,무정형 및 미성숙형의 정자를 증가시킨다. 미부의 기형과 미성숙 정자의 출현은 정소상체의 기능 이상과 관계가 있다. 보통 정액 검사상 다른 이상 소견도 함께 나타나지만 드물게는 이상형태만 나타나는 경우도 있다. 만약 기형 정자증만 있으면 일시적 현상일수 있으므로 30일 ∼ 70일 이내에 반복 검사를 시행해야 한다.

24 엄격한 정자 형태 분석 방법 엄격한 정자 형태 분석에서는 정자는 40-70%를 차지하는 첨체가 있는 미끈한 타원형이 두부(두부의 길이: 5-6μm, 폭: μm)와 경부, 중부 및 미부에 결함이 없을 때 정상으로 간주한다. 정자의 크기는 현미경 대안렌즈에 micrometer를 정착시켜 측정한다. 무정형 정자는 경미한 무정형과 심한 무정형으로 나누는데, 경미한 무정형은 머리의 폭이 이며 머리모양이 약간 불규칙이며 정상첨체를 가질 때를 말하며, 심한 무정형은 첨체가 전혀 없다든가 두부의 30%미만이나 70% 이상 존재할 때를 말한다. 두부의 형태가 완전히 비정상일 경우도 이 범주에 속한다. 경부의 결함도 경미한 결함과 심한 결함으로 구분한다. 경미한 결함은 두부의 모양은 정상이나 경부 부위에 어떤 것이 부착되어 있다거나 두꺼울 경우를 말하며, 심한 결함은 경부나 중부가 꺽어진 상태를 말한다. (보험분류 번호 나-730 E7300 병원금액 3400원/ 나 E7301 병원금액 10620원)

25 정자 형태

26 normal

27 Abnormal

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29 Semen Analysis (SA /IUI)
Chart No Specimen Colliiectd Name(Age) Date Husband name(Age) Time Clinical Diagnosis & Strict criteria Item normal Result Coagulation + + - Morphology > 30% Liquefation 30 min min Head defects Color Whitish gray W G Y Tapered Volume 2-6 ml ml Pyriform Sperm Counts >20x10(6)/ml Round WBC < 1x10(6) Amorphous RBC - Vacuolated Agglutination Small Acrosome Area Debris Twin Viability > 75% 2. Neck & Midpiece defects pH Bent neck Motility >50% % Asymmetrical insertion Rapid progressive Thick Slow or sluggish Thin None- progressive 3.Tail defect Immobility Short strict criteria >14 % Bent Coiled Immature germ cell 1.15x10(6)/ml

30 troubleshooting guide for the semen analysis
Outcome Probable reasons Response 비정상 소견의 정액 비정상적인 정액변수를 나타낸다 2주이내 재검 요망(2-3개월 후 재검) 48시간 금욕 후 채취하지 않은 경우 처음의 일부 사정액을 받지 못한 경우 2주안으로 분석을 반복하고, 전체의 사정액을 받는다. 채취와 검사에 시간이 지체된 경우 정액채취 1시간 이내에 검사를 실시 한다. 용기가 오염 된 경우 소독된 일회용 용기를 사용한다 정액 운반도중 현저한 온도 차이가 생긴 경우 온도의 변화가 없게 한다 (용기를 단열 처리한다) 사정후 액화 지연 비 정상적인 정액의 특성 정액을 파스퇴르 파이펫을 사용하여 풀어주고 사정액은 37도에서 유지한다. 높은 점조도를 보인 경우 파스퇴르 파이펫을 사용하여 풀어주거나 23-gauge로 샘플을 통과시킨다. 남편의 정액을 받을 수 없는 경우 정신적으로 연관된 요소들 남편이 채취에 스트레스와 유사한 주위의 것들이나 정신적 스트레스를 피한다

31 troubleshooting guide for the semen analysis
Outcome Probable reasons Response 샘플의 운동성이 느리다 비 정상적인 정액의 특성 2주안으로 분석을 반복한다 운동성분석을 한 슬라이드가 마른 경우 가능한 슬라이드 위에 샘플을 놓자 마자 운동성을 관찰한다. 정자 응집괴가 큰 경우 항체의 존재 항정자 검사를 한다. 운동성 있는 정자의 비율이 적은 경우 정자 생사검사시 문제 cover glass밑의 샘플이 마른 경우; 염색액을 너무 많이 넣은 경우 많은 박테리아나 WBC의 존재 감염 의사에 의한 약물치료 필요 Count시 정자수가 일치 하지 않을때 헤모사이토메터나 Makler챔버의 사용 미숙 계산판 사용의 준비; 계산판에 정자가 안정화 될 시간을 준다

32 IUI:intrauterine insemination
1) Sil-select (FertiPro N.V.) Method (1) Materials ① 생물 현미경, Centrifuge (swing-rotor), Heating Block, Makler Chamber, Semen Cup, Pasteur Pipette 또는 Serological Pipette, 15㎖ conical tube ② Sil-select upper/lower layer 또는 90% Sil-select, Sperm Wash

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34 Methods ① Sperm Wash와 Sil-select는 뚜껑을 꼭 닫아 배양기 또는 37℃ heating block에서pre-warming (최소 1시간) 시킨다. * Sil-select layer 형성방법 ․Sil-select upper layer 2㎖을 1㏄ 주사기를 사용해서 15㎖ conical tube에 분주한다. ․Sil-select lower layer 2㎖을 21G needle과 1㏄ 주사기를 사용해서 upper layer 아래쪽에서 needle의 끝 부분이 15㎖ conical tube의 바닥에 닿게 한 후 천천히 분주한다.

35 90% Sil-select를 사용할 경우 15㎖ conical tube에 90% Sil-select를 4∼5㎖ 씩 분주하여 사용한다. ② 받아온 정액을 37℃ heating block에서 30분 동안 액화시킨다. ③ 정액을 pipette으로 잘 풀어주고 15㎖ conical tube에 담아서 volume을 측정한다. ④ Makler Chamber를 이용하여 현미경 100∼200배 하에서 정자의 수, 운동성 등을 검사한다. ⑤ Sil-select layer에 정액 1∼2㎖을 천천히 loading하여 300g (1200∼1500 rpm)에서 20분 동안 원심분리 한다. ⑥ 가라앉은 정자 (pellet)를 15㎖ conical tube로 옮긴 후 Sperm Wash 4㎖을 넣어 잘 섞어준다. ⑦ 300g에서 다시 10분 동안 원심분리 한다. ⑧ pipette으로 상층액을 제거한 후 Sperm Wash 3㎖을 넣어 잘 섞어준다. ⑨ ⑦의 과정을 반복한다. ⑩ pipette으로 상층액을 제거한 후 tube를 흔들어서 pellet을 풀어준다. ⑪ Sperm Wash로 최종농도 30 × 106 /㎖이 되도록 맞춘다. (최종 count, motility 측정!) ⑫ IUI의 경우: 최종 IUI volume은 1㏄ 주사기에 0.6㎖ 정도로 한다. IVF의 경우: 수정능력 획득을 위하여 정자가 들어있는 tube의 뚜껑을 꼭 닫은 후 배양기 또는 37℃ heating block에서 2시간 이상 둔다. - count가 적고 운동성이 좋지 않을 경우에는 상온에서 보관한다. - count 및 운동성이 정상일 경우에는 배양기 또는 37℃ heating block에서 IVF 혹은 ICSI 수행 전까지 보관한다.

36 2) Washing Method ① ejaculation이나 biopsy했을 때 운동성이 거의 없거나 정자수가 거의 없어서 Sil-select를 돌릴 수 없을 때 사용한다. ② 정액양보다 5∼10배정도 많은 양의 Sperm Wash로 2∼3회 washing한다. * 정자의 상해를 방지하기 위하여 약하게 원심분리 한다.

37 3) Swim-up Method ① 정액을 몇 개의 15㎖ conical tube에 나누어 담고 그 위에 Sperm Wash를 분주한다. (정액 200∼250㎕ : Sperm Wash 500∼800㎕) ② 37℃ heating block에서 1시간 이하정도 둔 후 tube 바닥으로부터 swim-up된 정자들만 하나의 15㎖ conical tube에 모아서 사용한다.

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