PCR mediated mutagenesis 생화학 실험 II

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1 PCR mediated mutagenesis 생화학 실험 II
담당 조교 : 신진철,장지영

2 Polymerase Chain Reaction
특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능

3 Polymerase Chain Reaction
The three steps of PCR Step 1. Denaturation : double strand DNA 를 열에 의해 single strand 로 분리. Step 2. Annealing : DNA primer가 DNA 에 결합하는 단계. Step 3. Extension : DNA polymerase 에 의해 DNA 합성이 일어나는 단계.

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5 Overlap-extension PCR
OE-PCR은 PCR 방법을 이용하여 단백질 분자 내의 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 여러 방법 중 하나이다. 단백질 내의 특정 아미노산만을 다른 아미노산으로 변경하기 위해서는 치환 아미노산에 해당되는 DNA 염기서열을 유전자상에서 쉽게 치환할 수 있도록 해야 한다. 치환하고자 하는 DNA 염기서열을 변형시키기 위해서 OE-PCR에서는 4개의 서로 다른 primer들을 사용하여 두 번의 연속적인 PCR을 수행해야 한다 PCR-mediated INSERTION mutagenesis PCR-mediated DELETION mutagenesis Lee, J et al. BioTechniques 36, (2004)

6 Workflow of PCR mediated mutagenesis
Primary PCR using chimeric primers C ### ooo A ### ooo D ### ooo B Primary PCR A ### ooo ### ooo D Ligation PCR A ### ooo D

7 Primer design 시 주의사항 1) 길이는 20~30bp로 제한한다.
→ 너무 짧으면 결합력이 약하고 너무 길면 시간과 효율면에서 좋지 않음 2) G+C%가 50~60%로 구성되어야 하며 purine과 pyrimidine 염기의 연속적인 배열은 피해야 한다. 3) 한 쌍의 primer가 부분적으로 서로 상보적이지 말아야 한다. → primer-primer dimer의 형성 가능성을 배제하기 위함

8 Primer design 시 주의사항 4) Primer의 3’말단에 G or C 가 3개 이상 연속적으로 오지 않도록 한다.
→ 5’말단 sequence는 annealing에 크게 중요한 역할을 하지 않지만 3’말단 sequence는 PCR product가 extension하는 부위이기 때문에 PCR의 sensitivity와 specificity에 중요한 역할을 함. 3개 이상의 G or C는 비특이적인 증폭을 야기하므로 피하는 것이 좋음 5) Primer의 3’말단에 T가 오지 않도록 한다. → Thymine은 올바르지 못한 다른 염기와 misparing할 가능성이 높음 6) Tm값이 동일한 두 primer 설계 (또는 차이가 5℃이하 까지 설계) - Tm value = [4*(G+C) + 2*(A+T)] * annealing temp. = Tm – 3℃ (or 5℃)

9 Procedure : Primary PCR
Ingredient for PCR reaction (Primary PCR) Primary PCR condition Component Quantity per reaction Targets 1-10kb Distilled water 35ul 5x Herculase II reaction buffer 10ul dNTP mix 0.5ul DNA template 1ul Primer A+B : C+D Each 2.5ul/tube Herculase II fusion DNA polymerase Total reaction volume 50ul Temp.(℃) Time 95 2min 30sec 55 72 45sec 5min 30 cycles

10 Gel electrophoresis result
700bp : primer CD) 600bp : primer AB)

11 Report 제출기한 : 화요일(10/14) 오후 3시까지 > 늦게 제출 시 태도점수 감점
제출기한 : 화요일(10/14) 오후 3시까지 > 늦게 제출 시 태도점수 감점 제출장소 : S401호 (세포주기 연구실) Hand-writing 미 제출 시 0점 처리 인터넷의 자료를 그대로 이용 시 감점처리 기타 문의 사항은

12 Discussion Homework Gel Data 붙이고, 그 결과에 대해 분석할 것.
PCR의 세가지 step에 대해 설명할 것. 실험에 쓰이는 Material의 역할과 조성을 조사할 것. primer design할 때 유의사항에 대해 설명할 것. Homework