분자생물학실험 Total RNA extraction RNA quantitation CDNA synthesis RT-PCR

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1 분자생물학실험 Total RNA extraction RNA quantitation CDNA synthesis RT-PCR
Western blotting Yeast two-hybrid Electrophoresis RT-PCR CDNA synthesis RNA quantitation Total RNA extraction

2 RT-PCR (Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction) 분자생물학실험
SUBJECT RT-PCR (Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction)

3 분자생물학실험 RT-PCR (Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction)

4 분자생물학실험 Materials & Method PCR * Primer : SHR, SCR, ACT2
Template (cDNA) 3 ㎕ Primer FW/RV 0.5 ㎕ 5X Buffer 2㎕ Taq polymerase 0.1 ㎕ D.W. 4.4 ㎕ Total 10 ㎕ Step Temperature Time cycles Initial denaturation 95℃ 1min 1 Denaturation 15s 30 Annealing 58℃ Extension 72℃ 10s/1kb Final extension 5min

5 분자생물학실험 Real-Time qRT-PCR (Real Time quantitative Reverse Transcription PCR)

6 분자생물학실험 Result & Discussion
- 각각의 mutant background에서 유전자 발현정도의 차이를 비교해 봅니다. shr-2 mutant background에서 SCR의 발현이 낮게 나온 건 뒤에 설명. Point mutation이라 발현에는 문제가 없어 마치 기능이 소실되지 않은 양상의 band를 관찰 할 수 있습니다. 발현 정도의 차이를 비교할 때 ACTIN primer는 왜 사용 했는지? ACTIN이 무엇인지?

7 분자생물학실험 Result & Discussion SHR scr-5 SCR shr-2 shr-6 239(CAG->TAG)
앞의 발현양상 band 결과를 보면 shr-2 background에서 SCR 유전자의 발현이 낮게 나오는데, 이는 두 mutant중 shr-2가 null 이며, SHR이 SCR의 전사를 도와준다는 것을 말합니다. Abrash et al. (2009) Developmental cell 16: 787 shr-2 ATG SHR shr-6 scr-5 239(CAG->TAG) SCR ATG 0.1kb SHR, SCR은 transcription factor(TF) 입니다. SHR은 mobility가 있어서 stele에서 endodermis쪽 으로 이동이 가능합니다. 이동 후 SCR에 binding하여 SCR의 Transcription을 돕습니다. scr-5 mutant는 point mutation이 일어난 loss of function plant입니다.

8 조별로 사진이 정리 되어 있지 않아요. 실험 당일에 찍어간 사진과 비교하여 각자의 전기영동 결과를 ppt 자료와 비교하여 결과 레포트를 작성하세요.

9 분자생물학실험 다음 실험 예비 레포트 Yeast two hybrid - Yeast transformation