Spectrophotometer & Determination of Protein concentration

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1 Spectrophotometer & Determination of Protein concentration
Laboratory of Lipid Biochemistry 12th

2 : 분광광도계를 이용하여 sample 내에 포함된
Protein assay 단백질 정량 : 분광광도계를 이용하여 sample 내에 포함된 단백질의 농도를 측정하는 과정 정량 방법 1. 뷰렛 방법 2. Lowry 방법 3. Bradford 방법 4. BCA 방법

3 Spectrophotometer 특정 파장의 빛을 시료에 통과시킨 후 흡수된 빛의 양을 측정하는 기기.
시료의 흡광도는 시료의 농도 및 용기의 두께에 비례한다. 시료가 빛을 일정량 흡수할 때, 농도가 높다면 많이 흡수하게 되고, 농도가 낮다면 적게 흡수하게 된다. 그래서 흡광도를 측정하면 농도를 구할 수 있다. 이를 이용하여 standard curve를 그리고 시료의 단백질 농도를 예측할 수 있다.

4 Lowry protein assay Lowry reagent 시약에 의한 발색은 단백질과 알칼리성 구리와의 반응과 단백질의 아미노산에 의한 환원반응으로 생긴다. 1 단계 Biuret reaction : 알칼리 용액에서 Cu2+와 protein peptide bond 간에 complex를 형성시켜서 Cu2+가 Cu+로 환원된다. 2 단계 Folin-Ciocalteu reaction : Cu+와 tryptophan, tyrosine, cysteine의 radical group이 Folin-Ciocalteu reagent (phosphomolybdate and phosphotungstate complex(노란색))를 환원시켜서 진한 청색으로 변한다. (yellow→deep blue) 단백질에 750nm 파장의 빛을 통과 시켜 흡광도를 측정하여 standard curve를 그린다. 시료의 흡광도를 측정한 후 standard curve와 비교하여 시료의 농도를 예측한다.

5 Standard curve 이용하여 농도 측정
Standard protein : BSA (bovine serum albumin) 혈청에 녹아있는 단백질의 한 종류로, 송아지의 피에서 혈액 단백질인 알부민을 정제한 것 농도가 다른 5개의 Standard protein을 Lowry 시약에 넣어 spectrophotometer로 750nm의 파장에서 흡광도를 찍는다. BSA 농도 : 0 mg/ml, mg/ml, mg/ml, 0.75 mg/ml, 1.5 mg/ml Excel을 이용하여 가로축을 standard protein의 농도(mg/ml), 세로축을 흡광도(OD값)로 하여 그래프를 그린다. 추세선을 이용하여 수식을 구하여 주고 그래프의 기울기와 절편, r2 값을 구한다.

6 Material and Method Sample protein 1:5 dilution (in lysis buffer)
Standard protein (BSA) 5ul Sample protein 5ul Lowry reagent A 25ul Lowry reagent B 200ul Incubation at RT for 15 min 750nm에서 흡광도 측정

7 Result 농도를 아는 단백질의 흡광도를 측정하여 standard curve를 그리고, 정제한 단백질의 흡광도를 curve에 대입하여 농도를 구한다.

8 (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)
SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)

9 SDS-PAGE는 생화학과 유전학 및 분자생물학에 이용되는 단백질을 크기별로 분리하는 기술로, 그들의 전기영동 이동성(polypeptide chain의 길이 또는 분자량 뿐만 아니라 protein folding, posttranslational modification과 다른 이자들에 의한)을 이용한 기술이다.

10 SDS-PAGE gel Comb 여기에 정량한 단백질 넣음 Stacking gel Separating gel

11 SDS-PAGE gel ＊SDS-PAGE gel의 조성 및 역할 ＊ SDS-PAGE gel의 조성들의 역할
1> Stacking gel: 30% Acrylamide, 1.0M Tris-HCl(pH6.8), 10% SDS, 10% APS(Ammoniumpersulfate), TEMED, DW. ☞ 단백질을 한번에 동시에 출발하게 하기 위해서 2> Seperating gel: 30% Acrylamide, 1.5M Tris-HCl(pH8.8), 10% SDS, 10% APS(Ammoniumpersulfate), TEMED, DW. ☞ 단백질이 크기별로 분리되기 시작하는 곳으로써 Seperating gel의 acrylamide 농도가 높을수록 더 작은 크기의 단백질을 분리할 수 있다. ＊ SDS-PAGE gel의 조성들의 역할 1> Acrylamide(4℃보관): gel의 중합체를 형성해준다. 2> SDS: 단백질들을 음전하로 만들어 준다.(즉, denaturation시킴.) 3> APS(4℃보관): Gel을 굳게 해주는 역할을 한다. 4> TEMED: APS 촉매제로써 gel을 빨리 굳게 해준다. 5> Isopropanol: seperating gel과 stacking gel의 경계면을 평평하게 만들어 준다.