PCR과 Electrophoresis를 이용한 chromosomal DNA의 복제 및 분석

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1 PCR과 Electrophoresis를 이용한 chromosomal DNA의 복제 및 분석
서강대학교 화학과 하지민

2 중합효소 연쇄반응 (PCR, polymerase chain reaction)
1. 변성 (Denaturation) 2. 결합 (Annealing) 3. 신장 (elongation, polymeration) 1. 변성 (Denaturation) DNA 가닥이 떨어지는 과정이다. 열로 두가지 이중나선 구조인 DNA를 단일 사슬구조로 풀어버린다. 이때 온도는 약 섭씨 94도 정도로 이 때의 온도를 열 변성을 일으킬 수 있는 온도, 즉 Tm이라고 한다. 2. 결합 (Anealing) 세균에 primer가 붙는 과정이다. 원하는 부위의 염기서열에 상보적인 프라이머의 제작이 중요하다. 온도는 50도 정도로 낮춘다. 3. 신장 (elongation, polymeration) 이 primer에 이어서 약 섭씨 74도의 온도로 Taq polymerase를 이용한 DNA 증폭을 한다. 이 세 단계를 1 cycle이라고 하며 계속 반복할 수 있다. 한 사이클이 지나면 DNA의 수는 2의 제곱으로 늘어난다. Pcr 할때 dna를 벌리는 건 바로 온도입니다. dna는 서로 이중나선으로 되어있는데 그 가운데를 연결하는 게 바로 수소결합입니다. 그래서 열에 좀 약한 편입니다. (공유결합에 비해서..) 그래서 열을 올려주면 이중나선이 서로 분리되는 것입니다. 보통 70도 정도면 반정도 분리되고 90도 이상이면 완전히 분리된다고 합니다. 그래서 denaturation 때의 온도를 90도 이상으로 처음에 주는것입니니다.

3 primer PCR은 DNA분자의 특정부위를 선택적으로 증폭 시킨다. 어떤 DNA분자의 어떤 부위라도 선택될 수 있다.
두 개의 짧은 oligonucleotide가 이중나선의 각 가 닥과 혼성화되어야만 한다. 증폭될 부위의 범위를 정해주는 이들 oligonucleotide들은 DNA합성반 응을 위한 primer이다. 피시알에서 쓰이는 프라이머는 작은 주형의 디엔에이입니다. 보통 사이의 뉴클레오타이드로 구성되어 있습니다. 피시알로 증폭하고자 하는 디엔에이부분에 맞는 프라이머를 만들어 피시알을 행하면 원하는 부분이 증폭되는데 바로 이건 디엔에이 폴리머라아제 (DNA Polymerase)의 특성때문입니다. DNA Polymerase는 어떤 조그만 프레그먼트가 없으면 증폭하지 못하는 성질이 있습니다. 생체에선 작은 RNA primer를 만들어 주면 이것을 인지해서 증폭을 하게 되는데 피시알은 생체가 아니라 시험관에서 하는것이라 그냥 작은 디엔에이 조작을 넣어주는 것입니다. 이것이 annealing온도에서 원하는 부분과 결합을 해서 증폭을 하게 되는것이죠... 즉 프라이머는 증폭하고자 하는 곳을 DNA Polymerase가 인지할수 있도록 해주는 작은 DNA fragment라고 생각하시면 되는 겁니다.

4 Primer 설계상의 주의점 Primer 길이 Primer 간의 상보성 GC 함량 Primer 내의 2차구조 Tm 값 농도

5 결합온도 값(Tm) 구하기 이상적인 결합 온도는 primer 주형 결합체의 temperature of melting(Tm)에 따라 결정된다. Tm=(4 x {G+C} + (2 x {A+T})℃ 위 식에서 {G, C, A, T}는 primer에 존재하는 G, C, A와 T의 개수. 그러므로 PCR의 결합 온도는 각 primer들의 Tm 값을 계산함으로써 결정되며 이보다 1-2℃ 낮은 온도를 이용한다. 이상적인 결합 온도는 primer와 주형간의 결합이 가능할 정도로 충분히 낮아야 하지만 잘못된 염기쌍의 형성을 방지할 수 있을 정도로 충분히 높아야 한다. 이 온도는 primer 주형 결합체의 temperature of melting(Tm)에 따라 결정된다. Tm이란 정확하게 결합된 염기쌍들이 분리되는 온도이다. 이u Tm보다 1-2℃ 낮은 온도는 primer와 주형이 결합하기에 충분히 낮으나 하나의 잘못된 염기쌍을 포함하기에는 너무 높다. Tm은 실험적으로 결정될 수 있으나 보통은 간단한 공식으로부터 계산될 수 있다. Tm=(4 x {G+C} + (2 x {A+T})℃ 위 식에서 {G+C}는 primer에 존재하는 G와 C 뉴클레오티드의 개수이고, {A+T}는 primer에 존재하는 A와 T의 개수이다. 그러므로 PCR의 결합 온도는 각 primer들의 Tm값을 계산함으로써 결정되며 이보다 1-2℃ 낮은 온도를 이용한다. 이것은 두 개의 primer가 동일한 Tm값을 갖도록 디자인되어야 한다는 사실을 의미한다. 만일 그렇지 않을 경우에는 한 primer에 대한 결합 온도는 다른 primer의 결합 온도보다 너무 높거나 너무 낮게 될 것이다.

6 전기영동(electrophoresis)
전기장 안에서 하전된 입자(이온)가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 들과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단이다. 전기영동(electrophoresis)은 전기장 안에서 하전된 입자(이온)가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 따라서, 어떤 용액에서의 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결정된다. 그러므로 전기영동 법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 들과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단으로 이용된다.

7 전기영동법의 종류 (1) 이동계면 전기영동법 (2) 띠 전기영동법 전하에 미치는 pH의 영향
(1)이동계면 전기영동법 분리하고자 하는 분자들이 용액 내에 산재해 있는 상태에서 전류를 통하여 용매와 용액사이 또는 용액과 용액사이에 계면을 이루게 한다.  미량으로 존재하는 단백질의 전 단계의 분리와 같은 극히 제한된 부분에 이용된다. (2) 띠 전기영동법 소량의 시료용액을 지지체에 실은 후 전류를 통하여 주면 시료의 성분들이 점 또는 띠를 이루면서 이동한다. 시료에 있는 성분들을 육안으로 확인 가능하다. 전하에 미치는 pH의 영향  - 단백질과 같은 분자의 표면 전하에 미치는 pH의 영향은 이온화가 가능한 기(group)들의 수와 유형에 따라 좌우된다. 이러한 산성 또는 염기성기들의 효과는 단백질이 고유pH(등전점 pI)에서 순 영전하로 된다. 등전점보다 낮은 pH에서 단백질은 순 양전하를 나타내며 pH가 감소할 수록 순 양전하는 증가하고, 전기영동에서 단백질의 이동이 증가된다. 등전점보다 높은 pH에서는 단백질은 순 음전하를 가지게 되며 pH를 높임에 따라 이동도도 증가할 것이다. 그러나 이 경우 방향은 반대가 된다. 분자 전하에 대한 pH의 효과는 이온 교환에서와 같이 전기영동에 있어서도 중요하다. 이와 같은 현상은 산과 염기들에서도 나타나는데, 차이점은 pH의 변화에 따라 전하의 극성은 변하지 않고 단지 전하의 크기만 변한다는 점이다. 예를 들면, pI보다 상당히 낮은 pH(적어도 pH 단위로 2이하)에서 산은 본질적으로 이온화 형태로 존재하므로 전기영동에 기여하지 못하게 된다. 아울러 실제에 있어서는 전기영동적 이동도와 전하 사이의 상호 관계는 더욱 복잡하게 나타난다. 하지만 pI의 개념은 효과적으로 이용할 수 있다.

8 지지체에 쓰이는 젤의 종류 거름종이 아세트산 셀룰로오스 한천 젤 녹말 젤 아크릴아미드 젤 아가로즈 젤 ① 거름종이
아세트산 셀룰로오스  한천 젤 녹말 젤 아크릴아미드 젤  아가로즈 젤 ① 거름종이  값이 싸고 사용하기 편리한 지지체이다. 그러나 분리하려는 물질들이 셀룰로오스에 흡착이 잘 되어서 전기영동그림의 띠들 사이의 경계가 선명하지 못한 것이 결점이다. ② 아세트산 셀룰로오스   아세트산 셀룰로오스의 히드록시기를 아세틸화한 것으로서 분리시간이 짧다. 거름종이 보다 깨끗이 분리되므로 검출하기 쉽고 아세트산 셀룰로오스는 여러 용매에 쉽게 용해되므로 빠르고 쉽게 회수할 수 있는 장점이다. ③ 한천 겔  투명하기 때문에 광도계를 쓰는 측정에 적당하며 사용이 간편하다. 특히 슬라이드를 이용하는 면역 전기영동법에 많이 사용되며 한천 겔에서 agaropectin을 제거한 agarose는 최근에 DNA, RNA 및 플라스미드 등을 분리하는 데 유용하게 쓰인다. ④ 녹말 겔  녹말 겔의 구멍의 크기는 녹말의 종류, 완충용액의 종류 및 pH에 따라 결정되며 분자를 거르는 체의 구실을 한다. 한천 겔을 쓸 경우보다 시료가 많이 필요하고, 분리된 물질을 용출하기 어려운 것이 결점이지만 여러 동질효소(isoenzyme)를 분리하는 데에 널리 사용되고 있다. ⑤ 아크릴아미드 겔   서로 다른 그물조직을 가진 두 가지 아크릴아미드 겔을 포개어 불연속적인 층을 이루게 하여 사용한다. 이 경우 지지체의 그물조직의 구멍의 크기는 아크릴아미드의 농도를 변화시킴으로써 임의로 바꿀 수가 있다. 상층의 덜 촘촘한 겔은 단백질 같은 하전된 알맹이를 농축하는 역할을 하는 stacking gel이므로 이 부분을 통과한 시료는 뚜렷한 때를 형성한다. 아크릴아미드 겔은 성분들의 전하에 따라서 분리할 수 있을 뿐 아니라 분자를 질량에만 의존하는 분리가 가능하다. 단백질의 분리, 정제한 단백질의 순도 검정, 단백질의 분자량 측정 그리고 DNA의 염기 결합순서 결정 등에 이용되고 있다. 소량의 시료를 사용하여 단시간에 시료 혼합물을 분리할 수 있는 장점이 있다. ⑥아가로즈 겔 아가로즈 겔(agarose gel)에서의 전기영동은 보다 진정한 의미의 전기영동으로써 하전된 분자들은 전기장의 영향에 의해 이동하나 지지 물질에 의해 저지되지 않는다. 아가로즈 겔을 이용한 전기영동은 가장 큰 거대 분자와 그 복합체인 바이러스, 효소 복합체, 지질단 백질(lipoprotein),핵산(nucleic acid)등의 전기영동에 이용되고 있다.  단백질의 경우 폴리아크릴아미드 겔을 쓰나 분자량이 큰 고분자를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 하면 폴리아크릴아미드 농도가 줄어들어야 하므로 겔이 너무 약해 다루기 어려워진다. 그러므로 0.8% 아가로즈 겔을 쓴다.

9 실험 방법 ① micro tube에 정량한 모든 시약을 넣고 뚜껑을 닫는다. ② 시약이 잘 섞이도록 볼텍싱으로 Down시킨다.
③ PCR에 tube를 위치시킨뒤 뚜껑을 닫는다. ④ 기계의 온도와 싸이클(30회)을 설정한다.    -1단계 denaturation: 5분, 95도    -2단계 annealing: 1분, 55도    -3단계 polymerization: 5부, 72도

10 ① 삼각플라스크의 TAE buffer에 agar 0.3g을 넣는다.
② 시료를 간단히 흔들어 섞어준 후 랩으로 입구를 살짝 막고 전자레인지에 1분간 가열한다. ③ 꺼낸 플라스크를 식힌 후 EtBr을 가한다. (EtBr은 발암물질 이므로 피부에 닿지 않도록 주의.) ④ 시료를 holder에 붓고 15분간 식히며 굳게 한다. ⑤ 젤 형태로 굳으면 holder를 전기 영동기에 꽂는다. ⑥ 젤의 첫 홈에 ladder 혼합용액 6μl을 주입한다. ⑦ 젤의 나머지 홈에 PCR을 마친 DNA 4μl를 주입한다. ⑧ 전기를 흘려 보낸다. ⑨ 전기 영동기를 끄고, holder를 꺼내어 UV 광학기에 젤만 빼서 올려 UV를 켠 후, 형광 띠를 확인한다. 5. 실험 시 유의사항 ① 원심분리기의 사용 시 대칭을 맞추어 같은 양으로 튜브를 꽂아주어 같은 양으로 수평을 맞추도록 한다. ② 완충용액이나 기타 화학물질이 신체에 닿지 앉도록 실험복과 실험장갑을 반드시 착용하며, 페놀을 취급 시에는 보호경과 마스크를 착용하여야 한다. ③ 피펫은 항상 스탠드에 세워두도록 하며, pippet tip의 recr는 이물질이 들어가지 않도록 항상 닫아둔다. ④ PCR에 필요한 시약들은 보관법을 숙지하여 적절하게 준비한다. ⑤전기 영동시 EtBr은 발암물질이므로 신체에 닿지 않도록 각별히 주의를 기울이고, 관련 기기와 소모품들은 특별관리 및 처분한다.(Agarose gel 등) ⑥ UV 광학기의 자외선을 눈으로 직접 쐬지 않도록 주의한다.

11 실험결과 mgsA bp: 459bp gldA bp: 1104bp
끝에 흐릿하게 보이는 것은 크기가 작은 primer에 EtBr이 염색되어 발광하는 것이다.

12 Real-time PCR 정성 분석에 있어서의 Real-time PCR의 장점
(1) 조작이 간편하고 신속한 결과를 얻을 수 있다. (2) Contamination의 위험이 낮다. 정량 분석에 있어서의 Real-time PCR의 장점 (3) Broad한 dynamic range로 정확한 정량 가능. 그러나 단순히 PCR을 이용하여 DNA를 증폭시키는 것은 약간의 오차에도 큰 변화를 일으키기 때문에 dna chip등 환자의 병명을 알아내어 빨리 치료를 해야 하는 순간에는 적합하지 않을 수 있다. 다른 방법으로 생각할 수 있는 것은 Real-Time PCR이다. Real-time PCR(Polymerase chain reaction)은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치로, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 target DNA의 양을 분석하는 장비이다. 일반 PCR 같은 경우는 결과물만을 전기영동으로 확인하기 때문에 몇 번째 cycle에서 얼마나 증폭 되었는지 아니면 증폭이 더 이상 증폭되기 힘든지, 시료의 농도가 너무 높아서 다른 시료와의 양적 비교가 힘든지 등을 알기 힘들다. 하지만 Real-Time PCR로 하면 중간에 증폭되는 것을 그래프와 수치로 보여주므로 각 시료별로 정량이 용이하다. 그렇기 때문에 일반 PCR의 경우는 보통 전기영동 후 band의 농도를 눈으로 확인하는데 반해 Real-time PCR은 PCR 증폭 산물의 확인을 위한 전기영동이 필요 없으며, 증폭이 지수함수 적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 보다 정확한 정량이 가능한 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.. 만일  PCR 과정을 Real-Time PCR으로 대체했다면 전기영동하는 시간을 절약할 수 있다.