미생물 실험의 기초 강원도가축위생시험소.

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1 미생물 실험의 기초 강원도가축위생시험소

2 목 차 가. 미생물 검사의 개요 나. 기구의 세척과 멸균 다. 배지와 시험용액 제조 라. 검사시료 채취 및 접종

3 식품의 품질관리(신선도, 변패・부패의 진행판정)
미생물검사 개요. 1 미생물검사의 목적과 의의 식품의 품질관리(신선도, 변패・부패의 진행판정) 병원성미생물 오염여부 확인 식품의 안전성확보 소비자의 건강보호

4 미생물 검사 구분 미생물검사 개요. 2 오염지표미생물검사 1. 일반세균수 병원성미생물검사 1. Salmonella spp.
2. 대장균군 3. 대장균(E. coli) 병원성미생물검사 1. Salmonella spp. 2. E. coli O157:H7 3. Listeria monocytogenes 4. Staphylococcus aureus 5. Clostridium perfringens 6. Vibrio parahaemolyticus

5 주 의 사 항 미생물검사 개요. 3 실험자 준수사항 미생물 실험에 임하는 실험자는 병원성미생물의 감염 위험성을 항상
염두에 두고 아래사항을 준수한다. 1. 실습복(laboratory coat)를 착용 2. 실험대를 청결히 유지 3. 실험실 내에서는 절대금연 4. 음식물 섭취 금지 5. 실험시에는 불필요한 잡담 자제 6. 실험이 끝나면 실험대와 손을 깨끗이 세척 7. 실험이 끝난 시료는 폐기물 처리법에 준하여 배출 8. 배양이 끝난 배지나 실험기구는 멸균 후 배출

6 기구의 세척과 멸균. 1 세 척 법 시험관, 비이커 등 초자류는 거즈, 솔 등에 합성세제를 묻혀 씻고 충분히 수세한 뒤 건조기에서 건조하여 사용한다. ( 수세 과정 후 증류수로 washing) pipette은 수압을 이용하여 씻는다. 이물질이 부착되어 잘 제거되지 않거나 직경이 작은 vial 등을 세척할 때는 초음파세척기에 세제를 풀어 넣고 sonication 한 뒤 수세한다.

7 멸균법의 종류 기구의 세척과 멸균. 2 멸균의 개념 : 비영양형 상태인 spore까지 사멸
멸균의 확인 : B. stearothermophillus의 아포를 함께 멸균하여 확인. 멸균 indicator tape 이용 건열멸균 (dry heat sterilization) 습열멸균 (moist heat sterilization) 여과멸균 (filtering) 초자류나 철제류(scissor, forcep) 조건 : 160℃ 30분 이상 고압증기멸균(autoclaving) 주로 배지의 멸균에 이용 조건 : 121℃ 15 lb 15~20분간 열을 가하는 멸균법에서 변형될 위험성이 있는 재료

8 멸균 indicator tape B. stearothermophillus
고압멸균기(autoclave) 건열멸균기(dry oven)

9 멸균법의 과정 기구의 세척과 멸균. 3 1. 건열멸균 2. 습열멸균 3. 여과멸균
- 준 비 : 대상물을 신문지나 은박지로 wrapping - 건열멸균기에 넣고 온도를 높여 160℃ 30분 이상 정치 -> 온도가 100℃ 이하로 내려가면 내용물을 꺼낸다. - 주의 : 멸균기 내벽에 직접 접촉하지 않도록 함 (연소할 위험) 2. 습열멸균 - 준비 : 멸균할 내용물을 넣은 초자 capping (시험관은 마개를 덮고, 플라스크는 은박지로 덮는다) - autocalve에 넣고 121℃ 15 lb 에서 15~20분간 멸균 -> 압력이 0 이 된 것을 확인한 후 내용물을 꺼낸다. - 주의 : 사용시 증류수 보충, 시간준수, 내용물은 적정량만 채운다. 3. 여과멸균 - 여과기를 이용하거나 일회용 syringe filter 사용

10 배지 (medium)의 개요 배지와 시험용액의 제조. 1 1. 정의 : 미생물을 생존, 증식시키기 위해 적당량의 영양성분
을 혼합해서 만든 인공적인 환경 2. 성분 : 물, 탄소원, 질소원, 미네랄, 비타민 및 발육인자 3. 중요성 colony 의 특성, 생화학적 특성, 당분해성상 반영 -> 세균의 분리, 동정과 연구에 이용 4. 배지의 선택 : 목적에 따라 배지의 종류, 구성성분, 제조방 법을 선택

11 배지의 종류 배지와 시험용액의 제조. 2 배지의 분류 : 사용목적, 배지의 상태, 배지의 재료를 기준 사용 목적에 따른 분류
배지 조성에 따른 분류 물리적 성상에 따른 분류 액체배지 고체배지 평판배지 고층배지 사면배지 반사면배지 반고체배지 천연배지 합성배지 증식배지 증균배지 특수증균배지 선택배지 확인 또는 감별배지 수송용배지 보존배지

12 배지의 주요성분 배지와 시험용액의 제조. 3 - 근육 또는 장기의 수용성 침출물을 추출농축 제조성분
펩톤 (peptone) - 카제인, meat 등의 단백질을 효소로 분해하여 제조한 성분 - carbon 및 nitrogen source - 근육 또는 장기의 수용성 침출물을 추출농축 제조성분 - 염류, 당분, 아미노산, 핵산 및 발육성분 제공 - extract(liver, brain, kidney) : 환원물질 다량 함유 -> 혐기성 균에 사용 Beef extract 또는 Meat extract 효모추출물 (Yeast extract) - 효모에서 추출한 수용성 침출물질 - 염류, 당분, 아미노산, 핵산 및 발육성분 제공 한천 (agar) - 해조류, 조류에서 추출한 다당류(polysaccharide) - 영양성분이라기 보다 배지를 고체화 시키는 성분 기 타 - carbohydrate류, buffer, 억제제, 지시약

13 배지의 제조 배지와 시험용액의 제조. 4 1. 과 정 2. 주의사항 배지를 만들 양의 ½의 증류수를 먼저 플라스크에 넣고
-> 배지의 정확한 양을 저울로 달아 플라스크에 넣는다 -> 나머지 ½의 증류수로 기벽에 묻은 내용물을 씻어낸 다음 -> stirrer와 magnetic bar를 이용해 내용물을 완전히 녹인 후 멸균 2. 주의사항 - 너무 장시간 가열하거나 필요이상의 온도나 압력을 가하지 않는다. (배지 성분 파괴) - 배지의 지정된 pH 를 맞추어 준다. - 배지 제조용량보다 2배이상의 플라스크를 사용한다. (끓어 넘침 방지)

14 배지의 분주 배지와 시험용액의 제조. 5 1. 액체배지 (broth) 충분히 녹인 후 시험관에 미리 분주하여 멸균한다.
2. 평판배지 (plate media) 멸균이 끝난 후 배지가 들어있는 플라스크를 50도 이하로 식힌다 (클린벤치에서 petridish를 개봉하여 labelling : 날짜, 배지종류 등) -> 수시로 플라스크의 입구를 화염멸균하면서 label된 각각의 petridish에 15-20ml씩 신속히 배지를 붓는다. -> 배지가 굳으면 만들어진 배지 중 2~3개 정도를 37 incubator에서 배양 -> 랩 등으로 싸서 뒤집어 냉장보관 한다. 3. 사면/ 반사면베지 (slant/semislant media) -> 사면배지는 약 45도의 경사를 유지하도록 기울여 굳힌다. 반사면배지는 상부1/3정도 경사지도록 기울여 굳힌다. -> rack에 세워서 냉장보관

15 일 반 사 항 검사시료의 채취. 1 유의사항 - 검사시료 중의 미생물이 증식 또는 사멸하거나 오염될 가능성
-> 시험과정의 무균조작과 실험실 내의 청결이 중요 !! 방 법 - 시료 채취 시 사용되는 도구, 희석액, 용기 등은 멸균된 것 사용 - 시료 채취 전 실험대 소독, 손 세척 후 장갑착용 - 시료 채취 용기나 포장지의 내부를 만지지 않도록 주의 - 시료 채취 전 충분히 교반 - 불균질 시료의 경우 여러 부위(최소 3부위 이상) 에서 채취 기 타 - 검사는 시료 채취 당일 실시하는 것이 원칙 - 당일 검사 불가능 시 : 냉장보관 후 24시간 내에 검사

16 시료 채취 (완제품) 검사시료의 채취. 2 1. 준비 2. 과정
- 준비물 : 알코올램프, 알콜솜, 알콜스프레이, 멸균된 가위와 겸자, 저울, stomacher, stomacher bag, 멸균한 시료채취용기 - 희석액 : 멸균생리식염수, 인산염완충희석액(BPD) 2. 과정 포장된 외부를 알콜솜으로 소독한 후 가위로 개봉 -> 채취용기 또는 stomacher bag에 시료 10g을 달아 넣는다. -> 희석액을 더해서 total 100g을 맞춘다. -> stomacher에서 균질화 한다. (<- 시험용액)

17 시료 특성에 따른 시험용액 조제 검사시료의 채취. 3 액상시료 고체시료 반유동시료 표면시료 버터,아이스크림 분말상시료
멸균된 가위로 잘게 잘라→10배희석 →균질화 채취된 시료를 강하게 진탕하여 혼합 반유동시료 표면시료 일정면적 (100cm2)을 희석액(5-10ml)으로 적신 거즈로 swab →일정희석→균질화 멸균유리봉 등으로 잘 혼합-> 10배 희석->균질화 버터,아이스크림 분말상시료 냉동축산물 멸균 유리봉 등으로 혼합 →10배희석 포장상태 그대로 용해 (40도이하)→10배희석 →균질화 온탕에서 용해 (40도이하)→10배희석 →균질화

18 도체에서의 시료 채취 검사시료의 채취. 4 준비 과정 (소)
- 준비물 : 멸균거즈나 스펀지, 시료채취틀 (100cm2), 멸균용기나 봉지 - 희석액 : 멸균생리식염수, 인산염완충희석액(BPD) 과정 (소) - 채취부위 : 옆구리, 가슴, 둔부의 3부위 -> 거즈나 스펀지를 멸균용기에 넣고 희석액으로 적신다 -> 멸균장갑 착용 후 도체에 접촉될 면을 피해 스펀지를 꺼낸다. -> 다른 한 손으로 채취틀의 바깥 가장자리를 잡고 도체 면에 댄다 -> 도체의 면을 가로 10번, 세로 10번 swab -> 스펀지를 멸균봉지에 넣고 실험실로 운반 -> 적정량의 희석액으로 희석하여 시험용액으로 사용

19 도체에서의 시료 채취 검사시료의 채취. 5 (돼지) - 채취부위 : 목부위, 복부, 둔부의 3부위 - 과정은 소와 동일 (닭)
- 채취대상 : 포장하기 직전의 도체 - 과정 : 멸균 봉지에 희석액 400ml를 넣는다. -> 멸균장갑을 끼고 도체를 멸균백에 넣는다. -> 멸균백을 밀봉한 뒤 30회(1분간) shaking -> 멸균 용기에 40ml을 담아 시험용액으로 사용

20 시료채취틀(Template) 및 시판시료채취 기구
50cm2    100cm2 시료채취 기구

21 시료채취준비 멸균광구병과 멸균테이프 멸균 가아제 준비 거어즈 (시료채취후, 시료채취전) 생리식염수 희석액 준비

22 닭의 시료채취 Chiller 통과한 도체 포장직전의 도체 선발 희석액(400ml)을 넣고 흔들기 50ml 튜브에 시료액 넣기

23 평판 배지 배지 접종법. 1 혼합분주 배양법(pour plate method)
-> 희석하여 둔 시험용액을 petridish에 1ml씩 접종한다. -> 멸균하여 식혀둔 배지를 15ml 정도 붓는다. -> 배지가 굳으면 위에 배지를 5ml 정도 더 부어 식힌다음 배양한다. 획선 배양법(streak plate method) -> 세균현탁액이나 세균이 배양된 액체배지를 잘 혼합 -> 멸균 면봉이나 백금이로 현탁액을 취한다. -> 평판에 획선 접종한 후 배양 * 4분면에 single colony가 나오면 이상적

24 획선 배양법

25 Streaking Method

26 액체/사면 배지 배지 접종법. 2 액체 배지 사면 배지 멸균 백금이로 집락을 취한다.
-> 액체 배지를 약간 기울여 시험관의 기벽에 대고 접종 -> loop로 잘 풀어 준 다음 vortexing 하고 rack에 세워서 배양 사면 배지 균주를 취한 백금선으로 배지 상부2/3 까지 천자 후 (시험관 중앙부를 직각으로 관통) 아래로부터 위쪽으로 올라오면서 배지의 사면에 지그재그로 획선접종 한 다음 배양

27 액체배지 접종법 사면배지 접종법

28 사면배지 접종법