HLA 검사 및 면역기능검사 진단검사의학과 김 명 희.

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1 HLA 검사 및 면역기능검사 진단검사의학과 김 명 희

2 HLA 검사 MHC(Major Histocompatibility Complex)
Highly polymorphic genes 항원인식 Recognition by T lymphocytes HLA(Human Leukocyte Antigen) Human MHC 면역성이 강해 타인에게 이식될 경우 강한 면역 반응 유도 HLA 유전자 Class I: HLA-A, -B, -C Class II: HLA-DR, -DQ, -DP

3 HLA Nomenclature A1, A2, A3, A9, A10, A11 ... B5, B7, B8, B12 ...
Cw1, Cw2 … DR1, DR2 … A*01:01 B*51:02 Cw*01:02 DRB1*04:05 A20 이 사라졌음

4 예제: Nomenclature A*01:0101 첫 번째 두 자리 01: serologic specificity A1
두 번째 두 자리 01: serologic specificity는 같으나 amino acid가 다른 A*0102, A*0103 등과 구분하기 위한 것 세 번째 두 자리 01: amino acid의 변화는 없고 sequence의 변화만 있는 A*010102와 구분하기 위한 것

5 * HLA 적합한 형제 공여자 선택하는 것이 중요
이식관련 면역검사 공여장기의 종류 신장 췌장 BM 심장 간장 생존가족 사체 ABO 혈액형 ++ HLA-A, B +* 비적용 ++* HLA-DR + HLA crossmatch MLC * HLA 적합한 형제 공여자 선택하는 것이 중요

6 HLA typing Serological method Cellular typing Molecular Analysis
Microcytotoxicity Cellular typing Mixed Lymphocyte Culture (MLC) Molecular Analysis PCR-SSP PCR-SSOP, Reverse SSOP PCR-SBT PCR-RFLP, PCR-RSCA, PCR-SSCP etc.

7 HLA typing – Serologic test
검사원리 보체의존성 세포독성검사 (complement-dependent cytotoxicity) microcytotoxicity test

8 HLA typing – Serologic test
- 현미경 판독 위상차현미경 X 100배 시야에서 판정한다 죽은 세포의 %에 의해 1+-8+의 score를 기록한다. % Dead Cells Score Interpretation % Negative % Doubtful negative % Weak positive % Positive % Strong positive

9 8 (strong positive, %) 6 (positive, 51-80%) 4 (weak positive, 21-50%) 1 (negative, 1-10%)

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11 HLA typing – DNA test 1. SSO (sequence-specific oligonucleotide) typing 2. Reverse-SSO (sequence-specific oligonucleotide) 3. PCR-RFLP typing 4. PCR-SSCP (Single-Stranded Conformation Polymorphism) 5. Direct sequencing 6. PCR-SSP (sequence-specific primers)

12 Sequence-Specific Oligonucleotide Hybridization

13 SSO probe

14 Reverse SSO HLA DNA typing

15 SSP (sequence-specific priming)
HLA-DR SSP typing 24 SSP PCR reaction

16 HLA high resolution typing(SBT)
각 locus specific PCR primer → polymorphism 갖는 부위의 DNA증폭 → sequencing primer 이용하여 sequencing 가장 정확한 고해상도 검사방법

17 HLA Crossmatch (교차시험) 환자 혈액 내에 공여자의 HLA 항원에 대한 항체가 존재하는지 검사 방법
(1) 보체의존성 세포독성검사 공여자 림프구 + 환자혈청 기본방법 - NIH법, 예민한 방법 – anti-human globulin (AHG) 방법 (2) 간접면역형광법 - 유세포분석기

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19 Cell isolation 1) Mononuclear cell isolation by density
2) Lymphocyte isolation 3) Subset purification – T-, B-lymphocyte isolation Nylon wool separation Immunomagnetic isolation using beads Augmentation with monoclonal antibody Rosetting with sheep RBC 각 cell들의 여러가지 차이점 Density, size, granularity, adherence, cell-surface marker phagocytic capability –을 이용하여 cell isolation을 시행 Immunomagnetic isolation using bead Leukocyte의 surface marker, surface immunoglobulin, specific recognition site를 이용하여 분리하는 방법 Lympho-KwikTM (One lambda, Inc.) Specific monoclonal antibody와 complement를 이용하여 non-lymphocytic cell을 lysis시킴 Lysed cell은 density centrifugation으로 분리 Test 목적에 맞게 5가지 Kit가 상품화되어 있음 Premixed cocktail of monoclonal antibodies, complement and a stable density gradient for lymphocyte Rosetting with sheep RBC Principle T cell 표면에 있는 sheep RBC (SRBCs)에 특이적인 receptor에 의해 rosette을 형성 CD2 – SRBC receptor Procedure 1mL lymphocyte suspension과 1mL 0.5% SRBC suspension을 혼합한 후 200g에서 5분간 centrifuge Cell pallet을 4℃에서 18시간 incubation후 resuspension Separation of E-rosette positive and E-rosette negative cells Density gradient centrifugation – use FH solution E-rosette T-cell 분리 NH4Cl로 RBC를 lysis

20 Mononuclear cell isolation
Ficoll-Hypaque (FH) separation Percoll separation High molecular sucrose polymer로 blood 점도를 높이며 적혈구의 molecular formation을 촉진

21 Method – Nylon wool separation
T-cell 분리 – warm(37℃, 8mL) 5% HIFCS washing, 2회 B-cell 분리 – iced 1.5mL HIFCS  squeezing, 5번 반복

22 판독 T 림프구 교차시험 양성 B 림프구 교차시험 양성 : HLA-A, B, C (class I)에 대한 항체가 있다는 의미
초급성거부반응과 관계되므로 이식의 금기 B 림프구 교차시험 양성 : HLA class II 항체, 약한 class I 항체, : 절대적 금기는 아니나, 높은 역가 (1:8 이상)인 경우 이식성적 저하.

23 FCM HLA X-match 검사원리 Indirect cross-match technique
Direct XM: CDC Indirect immunoflourescence Donor cell과 patient's serum을 incubation하여 binding 단계를 거친 후, FITC-conjugated anti-human IgG를 첨가하여 target cell에 반응된 patient's Ab를 detection Flow cytometry로 그 정도를 측정하여 항체의 유,무를 판정 낮은 농도의 Ab까지도 측정이 가능하다

24 CD3 monoclonal with fluorochrome conjugates
Fluoresceinated (FITC) Phycoerythrin (PE) Perdinin chlorophyll protein (PerCP) CD3 monoclonal with fluorochrome conjugates Specifically detect T cell reactivity CD19 or CD20 monoclonal with fluorochrome conjugates Specifically detect B cell reactivity Multi-color method NK cell, monocyte에 의한 background binding을 없앨 수 있음 2-color ; PE conjugated CD3 or CD20 3-color ; PE conjugated CD20 and PerCP conjugated CD3

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26 CDC Flowcytometry 장점 단점 Complement activation을 일으키는 antibody를 직접 확인
결과 정량화 가능 Cell 분리가 특별히 필요 없음 Alloantibody의 isotype 식별가능 민감도와 특이도가 높음 단점 민감도와 특이도가 높지 않음 살아있는 cell이 필요 시간, 노력이 드는 검사 실제 문제가 되지 않는 case에서도 양성 반응을 보일 수 있음

27 PRA (panel reactive antibody)
(1) 방법 - 보체의존성 세포독성검사 - HLA 항원을 아는 수십명 (30-60명)의 림프구로 구성된 panel을 이용하여 HLA 항체를 검사 - 양성 여부와 양성인 경우 림프구 panel 중 몇 %에 반응하는가(%PRA)와 HLA 항체 특이성을 판정하여 보고

28 PRA (panel reactive antibody)
(2) 목적 환자에서 HLA 항원에 감작된 정도(% PRA)를 파악 -> 교차시험 적합 공여자를 만날 수 있는 가능성 및 장기이식 대기시간 예측 - HLA 항체 특이성 동정 -> 공여자 선정시 피해야 하는 HLA 항원을 알 수 있어 불필요한 교차시험 방지 - 혈소판불응증 환자 : HLA적합혈소판 수혈

29 면역기능 검사 1. Immune system Cellular immune system – pph lymphocyte
Humoral immune system – serum 2. 검사 분류      1) 선별단계 : CBC/DC, lymphocyte subset, lymphocyte stimulation test, Ig 정량      2) 확진단계 : 재검, 병력 및 가족력                     피부반응검사, NK cell 활성도 검사, cytokine 생성검사, MLC                     연령에 따른 특이항체 존재유무, ABO 항체검사

30 세포면역기능의 검사법 - lymphocyte subset test  1) cluster of differentiation (CD) 2) 단클론성 항체를 이용한 면역형광법 : 형광현미경, FCM 3) CD4/CD8 ratio 림프구 분포 이용되는 단클론성 항체 T cell 50-70 % CD3, CD2, CD5    Helper T cell 30-50 % CD4    Cytotoxic T cell 20-40 % CD8 B cell 7-25 % CD19, CD20 NK cell 8-35 % CD16, CD56

31 Flow cytometer (FCM)

32 세포면역기능의 검사법 1) 피부반응검사 - 지연성 과민반응 : 항원표현세포에 의해 T세포에 항원이 전달 및
인지되어 증식되는 세포면역 과정을 전반적으로 평가     - 과거에 노출되었을 가능성이 있는 항원을 피내주사 2) 림프구 배양     - mitogen이나 항원 등의 자극을 통해 림프구를 모세포로 증식시켜 림프구의 증식정도를 보는 검사     - Stimulant Mitogen (PHA or conA for T cell, PWM for B cell)          Ag (Candida, tetanus toxoid, HSV, PPD) - in vitro skin test          allogenic lymphocyte (MLC)     - detection - number of blasts                     3H TdR incorporation assay                      FCM - DNA content

33 체액면역 검사법 1) protein - albumin 2) Ig 정량검사 ; IgG, IgM, IgA, IgE
  3) serum protein electrophoresis & IFE

34 체액면역 검사법 Polyclonal gammopathy

35 체액면역 검사법 Monoclonal gammopathy

36 Immunofixation electrophoresis (IFE)
체액면역 검사법 Immunofixation electrophoresis (IFE)