미생물 배양 관련 교육 해남군농업기술센터 김대성.

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1 미생물 배양 관련 교육 해남군농업기술센터 김대성

2 목차 멸균 1 종균 관리 2 종균 배양 3 배양 4 배양 후 관리 5

3 일반적인 멸균 항 균 균을 죽이는 것이 아닌 균의 번식을 억제시키는 것. 현 상태가 더욱 악화 되지 않게 억제만 하는 것.
시판되는 항균 99.9%는 억제효과만 있을 뿐 균을 죽이진 못함.

4 일반적인 멸균 살균 온도나 과정이 강력하지 못해서 모든 균을 제거하지 못함. 곰팡이, 탄저균, 파상풍균, 아포균 등은 존재.
습도 및 온도 조건이 좋아지면 다시 성장. 병균을 죽이는 것을 의미, 유제품 및 세정제에 주로 표기 99.9% 90% 50% 2.0*109 cfu 2.0*107 cfu 2.0*108 cfu 1.0*109 cfu Log 값 변환 Cfu 변환 9.3 0.093 약 1 cfu 99%

5 일반적인 멸균 멸균 모든 생명체가 제거되거나 죽은 상태를 말한다. 즉, 어떤 환경에서도 미생물의 증식을 불가능하게 만든다.
온도-121도, 내압-1.2기압, 시간-20분 이상의 조건을 유지. 멸균이 끝나고 온도가 떨어질 때 음압이 걸리면 안됨 위 조건에서 오염이 되면 dead zone이나 작업상의 문제임.

6 배양학적 멸균 특징 특정의 미생물만을 배양하기위해 다른 미생물을 죽이는 공정
습열가열살균만을 사용한다.(방사선, 화학물질 등을 사용못함) 변수가 많다.(미생물의 수, 종류, 배지의 조성, 입자의 크기, 배양기 등) 압력용기내에서만 멸균이 진행된다.(폐쇄적, 외부에서의 혼입 방지)

7 Bacillus stearothermophilus 포자
배양학적 멸균 여러가지 미생물의 살균시간 및 온도 세포 살균시간(분) 살균온도 영양세포 5 ~ 10 60 곰팡이포자/효모포자 15 80 Streptomyces 포자 60 ~ 80 세균포자 5 121 Bacillus stearothermophilus 포자 배지는 배지원료, 물, 용기로부터 다양한 영양세포와 포자를 포함한다. 멸균 공정은 배양상에 있을지 모를 모든 위험으로부터 특정 미생물을 보호하는 공정

8 배양학적 멸균 세균 온도 x 분 사멸곡선 60도 N 80도 N0 95도 121도 N0 : t=0에 있어서의 생균수
2 4 6 8 10 12 14 N N0 1 10-1 10-3 10-2 10-4 10-5 사멸곡선 N0 : t=0에 있어서의 생균수 N : 임의의 시간에 있어서의 생균수 60도 80도 95도 121도 살균시간 세균의 사멸온도 세균 온도 x 분 Bacillus anthracis(spore) 105 x 5 ~ 7 Thermophiles(spore) 100 x 840 120 x 12 130 x 2.2 Bacillus subtilis(spore) 80 x 75hrs 100 x 6 ~ 17 E. Coli(vegetable cell) 57 x 20 ~ 30 Clostridium botulinum(spore) 100 x 330 111 x 30 ~ 90 120 x 4 ~10 Streptococcus thermophilus 70 ~ 75 x 15 포자는 열에 대해서 강하므로 높은 온도와 긴 유지시간이 필요로 한다. 포자 및 균수는 온도가 높아지면 시간이 감소하게 된다 위 조건은 배지 및 버퍼가 없는 이론적인 사멸조건이다.

9 배양학적 멸균 혼합배양물의 사멸곡선 A : 배지성분 1 C N B B : 배지성분 2 A N : 임의의 시간에 있어서의 생균수
5 10 15 20 25 30 35 N 1 103 102 104 105 혼합배양물의 사멸곡선 N : 임의의 시간에 있어서의 생균수 살균시간 A A : 배지성분 1 C B B : 배지성분 2

10 배양학적 멸균 살균시간(min) 온도 흡광계수 pH 흡광 pH 온도 30 120 90 60 7.2 6.8 6.4 0.2 0.4
0.6 0.8 150 180 210 240 270 pH 흡광 pH 온도 이온결합의 발생으로 인해 혼합물의 생기기 때문에 흡광계수가 올라간다. 너무 장시간 멸균하면 오히려 배지성분에 변화가 생길 수 있다. 온도가 상승하면서 pH는 떨어지게 된다. 배지 성분간의 이온결합을 통해 H가 배양액 내로 환원되기 때문이다. 미생물마다 적정 멸균 온도가 다르기 때문에 단계적으로 멸균이 진행되어야 한다. 발효기 및 배지조성 등을 고려할 때 분당 1도씩 상승하는 것이 가장 알맞다.

11 배양학적 멸균 관성 접촉 확산 발효공기 배양기내 공기는 멸균공정 후 공급되기 때문에 필히 살균된 공기가 들어와야 한다.
일반적으로 외부 공기는 m3당 약100,000개의 입자와 약 2,000개의 미생물을 포함 공기의 멸균을 위해서는 여과, 가스주입, 방사선, 열 등이 필요하다. 관성 섬유에 의해 공기의 흐름이 바뀔 때 크거나 이동속도가 큰 미생물을 포집 접촉 유선과 섬유의 간격이 좁아 미생물이 공기의 흐름에 따라 이동중에 포집 확산 작은미생물은 filter자체의 포집율은 떨어지지만 미생물 특유의 Brown 운동으로 인해 공기의 흐름에서 벗어나 포집

12 종균 관리

13 종균 관리 배양을 시작하는데 필요한 모든 접종 균체를 말한다.
세균 배양시 보통 : 1의 비율로 돌연변이체가 발생한다. 장기간에 걸쳐 계대 배양하여 사용하면 본래와 다른 균으로 변질된다. 유전적 변이를 최소화하고 지속적으로 사용하기 위해 장기보존한다. 보존 전에 오염여부를 확인하여야 하고 대수증식기의 활성세균을 이용

14 종균 보관 방법 출처 : 한국종균협회 Plate 보관 고체배지에 streak한 후 냉장고에 보관.
뒤집어서 보관하며 고초균 1개월, 효모균 1개월, 유산균 2주간 보관. 플레이트내에 물이 생기면 폐기 한다. -> 물에 의해 colony 번진다. 출처 : 한국종균협회

15 종균 보관 모습 Glycerol stock 세균을 얼리면 ice formation으로 인해 손상을 입게 된다.
어느 속도를 천천히해 세균의 stress를 최소화 한다. 멸균된 glycerol 20%와 배양액 80%을 혼합하여 -20 ℃ 이하에서 냉동. 고초균은 1년, 나머지 균주는 약 6개월간 보존 가능

16 종균 보관 모습 고초균 2011.10. 11 동결건조 세균과 미생물을 오래 보존하는 가장 경제적이고 효과적인 방법
멸균된 skim milk 50%와 배양액 50%을 혼합하여 동결건조. 고초균 유리관내를 진공상태로 만든 후 유리관을 밀봉한다. -80도 보관 고초균은 약 10년, 나머지 균은 5 ~ 7년간 보존 가능

17 종균 stock 제조도 배지 50ml에 종균을 접종 종균의 특성에 맞춰 배양 동결 보존제 멸균
배양액, 동결보존제를 1:1로 혼합 멸균 vial에 1ml씩 분주 밀봉한 후 냉동 보관

18 종균 테스트 오염여부 확인 배양액과 글리세롤 혼합 후 고체배지에 streak하여 오염여부 확인
Stock 종균을 다시 액체배양하여 생장 및 오염여부 확인 생산성 확인 2차 대사산물을 생산하는 균주에 대해 생산성을 확인 Target으로 하는 식물병, 해충에 대해 길항실험 및 생물활성실험 진행

19 원균주 No. 01 No. 02 No. 03 No. 04 No. 05 No. 01-01 No. 01-02 No. 01-03
앰플 관리 원균주 No. 01 No. 02 No. 03 No. 04 No. 05 1 st No No No No No 2 nd 원균주에서 첫번째로 계대한 종균을 최우선으로 관리한다. 1st에서 계대하여 만든 2nd종균을 차례로 사용한다. 세대별로 종균이 5개 정도 남았을 때 다시 계대하여 앰플을 제작한다. 앰플이 오염됐거나, 균의 활력이 떨어졌을 경우 상위단계의 앰플을 사용한다.

20 종균 배양

21 배양방법 배양방법 정치배양 : 배지에 균을 접종한 후 정치하여 배양(주로 유산균에 사용)
진탕배양 : 왕복 또는 회전진탕 배양기 사용(고초균, 효모균에 사용) 교반배양 : 발효조에 무균공기를 공급함과 동시에 교반 진행(fermentor) 혐기배양 : 진공 또는 다른 기체로 치환하여 배양(데시게이터, 혐기Jar)

22 종균의 배양조건 균 종류 배지종류 Seed량 배양시간 배양온도 배양특성 고초균 TSB, LB 0.5% 6h. 37℃ 진탕배양
종균 배양 조건 균 종류 배지종류 Seed량 배양시간 배양온도 배양특성 고초균 TSB, LB 0.5% 6h. 37℃ 진탕배양 유산균 MRSB 12h. 정치배양 효모균 PDB 1% 30℃ 광합성균 센터에서는 종균 불가능 함.

23 광합성균 종균 배양 정치배양 종균배지로 특수 배지 사용 백열등으로 광 조사 온도는 30도 유지(중요) 약 7일간 종균 배양
광합성균 종균 배양기 정치배양 종균배지로 특수 배지 사용 백열등으로 광 조사 온도는 30도 유지(중요) 약 7일간 종균 배양

24 배양

25 미생물의 배양시 고려사항 배양시 최고의 결과를 얻기 위해 다양한 조건을 고려하여야 한다.
생산물의 안전성, 분리, 정제 등을 고려하여 최적의 조건을 확립하여야 한다. 구 분 고 려 사 항 배 지 ․영양원의 종류와 농도(탄소원, 질소원, 무기염류, 필수영양소 등) ․물리적 성상 - 고체, 액체, 점도 ․그 외의 첨가물 - 전구물질, 소포체 등 온 도 ․미생물마다 요구하는 최적온도를 사용 산 소 ․호기성균의 경우 - 배양기의 종류, 교반속도, 통기량, 공기의 압력, DO 등 ․혐기성균의 경우 – O2-free. 접 종 균 ․배양조건, 접종량 pH ․미생물마다 요구하는 최적 pH 사용

26 생장 온도 최적온도에 가까울수록 미생물의 생장속도는 지수적으로 증가한다.
activation Thermal death Temperature growth 최적온도에 가까울수록 미생물의 생장속도는 지수적으로 증가한다. 균에 따른 효소의 반응속도 역시 최적온도에 따라 증가하기 때문임. 저온에서는 효소의 활성이 떨어지고, 고온에서는 열변성이 일어나 저하됨. 구 분 증 식 온 도 (℃) 균 주 최 저 최 적 최 고 저온균 (Psychrophile) -10 ~ 0 10 ~ 20 20 ~ 30 Pseudomonas, Vibrio, Candida, Torulopsis, Cladosporium 균중 일부 중온균 (Mesophile) 5 ~ 15 25 ~ 40 40 ~ 55 대부분의 세균, 방선균, 곰팡이, 효모 고온균 (Thermophile) 50 ~ 60 75 ~ 85 Thermus, Bacillus, Clostridium 균중 일부, 고온성 곰팡이

27 배지의 pH 초기 pH 대부분의 미생물의 초기 pH는 6.5 ~ 7.4으로 조절한다.
종균과 메인 배지의 기질이 다르기 때문에 중성에서 적응할 시간 필요 배지 멸균 후 1M NaOH, 1M HCl로 배지 pH를 조절한다. 배양 적정 pH 각 균의 대수증식기 기간을 늘려주는 방법으로 pH를 사용 균 특성에 맞는 pH 환경을 1M NaOH, 1M HCl로 control해준다. 고초균 pH 5.8 ~ 6.0, 유산균, 효모균 pH 5.8,

28 용존 산소(D.O.)  is not dependent on DO. To get maximum growth, 
미생물의 산소이용 용해된 산소를 이용하여 증식과 생식에 이용한다. 기포와 배양액과의 접촉면에서만 공기가 용해돼 산소용해도가 극히 낮다. Air량과 내압, 교반속도를 이용하여 용존산소량을 조절하여 준다. DO  Critical oxygen concentration DO limits growth  is not dependent on DO. To get maximum growth, DO > critical conc. bac, yeast; 포화농도의 5-10% 유산균 : 포화농도의 5%  : 지수생장 계수

29 임펠라 발효조의 크기(m3) Impeller 속도(rpm) 0.02 (20 L) 250 ~ 450 0.2 (200 L)
크기와 교반속도의 관계 고초균 배양 기준 발효조의 크기(m3) Impeller 속도(rpm) 0.02 (20 L) 250 ~ 450 0.2 (200 L) 250 ~ 350 1 ~ 20 (1 ~ 20 ton) 120 ~ 180 40 ~150 (40 ~ 150 ton) 120 ~ 150 적정 rpm 수치 구하기 Rpm은 배양기의 크기 및 회사마다 조건을 달리 해주어야 한다. Jar의 지름 x rpm 속도 를 일정하게 유지 시켜준다.(간이 법)

30 임펠라 air Paddle 형 : 회전시 저항이 크므로 저속으로 운전한다. 수직방향에 흐름이 생긴다.
Propeller 형 : 복류와 축류의 합성류를 형성하여 교반효과가 높은 흐름이 생긴다. Turbine 형 : 복류를 주로한 흐름을 발생하며 강력한 교반에 적합하다. Foam breaker : 배양시 생기는 Foam을 없애준다. 배양액보다 항상 높은 위치에 존재

31 배양 Scale-up 과정 종균 종균 배양 메인 배양 순수배양된 균주 single colony 이용 혹은 앰플 사용
멸균된 액체배지 사용 균에 따라 배양 조건 및 배지 사용 발효기 용량의 70% 사용 약 0.5% ~ 3% 종균 접종 초기 pH 중요함. 500L 배양기 기준 350L 배양

32 고초균 배양 종균 배양 배지는 TSB, NB, LB 모두 균이 자라기 때문에 선택하여 사용한다.
베플이 달린 삼각플라스크에 50ml TSB 2개, 700ml TSB 4개 준비한다. A unit은 앰플 또는 보관중인 플레이트로 한다. B unit은 50ml TSB로 한다. (앰플 혹은 single colony 접종) C unit은 700ml TSB로 한다. (배양된 50ml TSB에서 7ml 접종)

33 Unit A unit 냉장 혹은 냉동 보관중인 종균을 말한다.
A unit 종균은 알맞지 않은 환경으로 인해 균주의 stress가 쌓인 상태 B unit Stress를 받은 종균의 활력을 키우고, 자연 돌연변이를 막기 위해 배양 Scale-up에 따라 중간 배양 단계로의 목적도 있음 C unit 배양 volume에 맞춰 접종량을 결정한다. 접종시 균주의 활력을 위해 대수증식기에 맞춰 배양 한다.

34 Unit A unit B unit C unit 앰플 혹은 plate 상태로 보관 배지 상태 확인 필수
50ml에 균을 접종한다. 되도록 면전을 사용한다. C unit 플라스크 volume의 40% 이상을 사용하지 않는다.

35 배양 스케쥴 – 종균 배양 준비 및 A unit C unit 배양 및 접종 B unit 배양 500L배양 기준
50ml TSB 2개 제조 700ml TSB 4개 제조 18시에 TSB 50ml에 종균 접종 배양 준비 및 A unit 온도 37도, rpm 90 진탕배양 50ml -> 700ml로 7ml 접종 함 C unit은 대수증식기 시간을 맞춘다. C unit이 배양되는 사이 배양기에 배지를 멸균 한다. 17시 C unit이 배양되면 현미경 검경 후 접종한다. C unit 배양 및 접종 온도 37도, rpm 130 진탕배양 초기 배지 색과 비교 했을 때 혼탁해 지면 배양 된 것 overnight하여 B unit을 배양 함. B unit 배양 12 18 24 06

36 고초균 메인 배양 조건 온도 37도 교반속도 200 rpm pH control 6.0(20% NaOH)
air 량 1vvm(30L/M) 내압 0.4 배양 시간 48h.(포자 lysis까지)

37 메인 배양 조건 500L 배양시 메인 배양 조건 균 종류 소포제d 배양온도 Air 량 내압 pH control 교반속도
배양시간 고초균 500ml 37℃ 1.0 vvma 0.4 5.8 ~ 6.0 배양기 및 볼륨에 따라 변동 48h. 유산균b 50ml 0.25 vvm 0.2 5.8 24h. 효모균 30℃ 0.5 vvm 광합성균c 25ml 0.6 7.3 섞일 정도만. a : Liter/minute으로 배양볼륨 100L였을 때 분당 50L의 공기를 공급함. b : 유산균은 완전 혐기균이 아닌 통성혐기성균이기 때문에 호기조건으로 배양함. c : 등의 밝기가 중요하며 약간 노란빛이 나는 할로겐등이 가장 효율적임. d: 소포제는 넣기 전에 완전히 물에 풀어준 다음 넣도록 한다. 또한 배양 중 거품이 발생할 수 있기 떄문에 삼각플라스 크에 물과 소포제를 1:1로 섞어 미리 멸균해 놓는다.

38 고초균 실제 배양 균이 분열하는 시기 운동성이 활발 분열이 끝난 후 균체내 소기관을 형성 균의 운동성 없어짐.
DO pH 균이 분열하는 시기 운동성이 활발 분열이 끝난 후 균체내 소기관을 형성 균의 운동성 없어짐. Lysis 완료 배양 종료 일정량 DO를 유지시켜 주어야 한다. Lysis 시작 (약 8시간 진행) 포자 형성 시작

39 포자 lysis 포자는 균이 생존하기 위한 번식 기관이다.
미생물 배양액의 안정성에 크게 기여한다.(1년 ~ 2년동안 안정성 유지) 미생물의 분열부터 사멸까지의 모든 배양 단계의 종료를 의미 더 이상 배양이 진행되지 않기에 포장 후 부풀어 오르는 현상이 없다.

40 광합성균 배양시 주의점 종균의 농도가 중요 종균의 O.D. 값을 측정하여 종균의 접종량을 결정한다.
배양 볼륨 L당 OD680nm = 1을 종균으로 접종하는 것으로 계산 종균의 OD값이 100인 경우 500L를 배양할 때 종균 5L 접종한다. 광의 종류 빛에 노란 빛과 빨간 빛이 보이는 등이 좋다.(할로겐 램플, 백열등 추천) 배양기 내부를 조도계로 측정했을 경우 2000lux정도 되게 빛을 조절 빛이 닿는 표면이 넓을수록, 등이 많을 수록 좋다.

41 배양 후 관리

42 배양 후 관리 세척 및 배양기 관리 생균수 측정 2차 대사산물 확인

43 세척 세척 고압세척기로 씻을 때 임펠라 및 베풀 사이를 잘 씻어준다.
소포제가 들어가는 경우 배양기 volume 윗부분은 무진천으로 닦아준다. 다음 배양까지 시간이 있을 경우 물만 채워 공멸균 진행(멸균배양기). 살균배양기의 경우 40% NaOH를 100L당 10ml 첨가하여 공멸균을 진행. 공멸균 시 DO 및 pH센서는 분리 후 멸균 진행(센서 수명 연장) 멸균 후 배양이 없을 시 물이 들어있는 상태 그대로 둔다.(압을 파기 X)

44 세척 오염이 계속 발생할 경우 Air compresser의 탱크의 바닥 밸브를 열어 응축수 제거 한다.
직접 조정할 수 있는 밸브 및 오링, 나사 등을 세척한다. 공멸균 후 온도가 약 80도 정도 됐을 때 다시 멸균을 진행한다. 각 밸브라인에 거품을 묻혀 라인에 공기가 새는 부위가 있는 지 확인. 수동 모드로 air 및 drain 필터를 장시간 멸균 후 확실히 건조 시킨다. Glucose 1%, Yeast extract 0.5%로 무균 배양 한다.

45 Air filter 멸균

46 drain filter 멸균 Drain filter 멸균
배양기 볼륨의 약 90%를 물을 채운 다음 공멸균을 진행한다. 이때, 멸균시간은 평소보다 10분정도 더 설정한다. 평소의 멸균시간이 끝난 후 나머지 10분 남았을 때 drain 을 수동으로 열어준다. 압력에 의해 물이 drain 부분으로 넘어가 필터나, 라인에 남아있는 배지 찌꺼기를 제거해 준다.

47 오염확인 Salmonella 확인 SSA배지에 광합성균 배양액을 spread 한 후 30℃에 배양
배양 1일 배양 3일 SSA배지에 광합성균 배양액을 spread 한 후 30℃에 배양 노란색으로 변했다가 검은색으로 변한 colony가 salmonella sp. 임.

48 오염확인 E. coli 확인 MacComkey sorbitol Agar에서 streak하여 30 ℃에서 배양 후 확인
Colony는 분홍색-빨간색을 띄며 colony주위에 분홍색의 halo가 보인다.

49 생균수 측정(pouring법) Pouring 법 10배 계열희석법을 이용하여 샘플의 생균수를 측정한다. 균수 측정법
배지상의 콜로니 수 x 희석배수 검사 단위 CFU/g or CFU/ml 유효범위 30 ~ 250cfu/plate Plate의 cfu가 일정한 비율로 나타나는 것을 확인

50 생균수 측정(spread법) 고체배지에 물기가 없는 것을 사용한다. 1주일 안에 제조된 고체배지만 사용한다.
도말봉을 단계별로 확실히 멸균한다.

51 하나의 희석배수에 25-250개의 colony가 있는 경우
생균수 계수방법 Case 각 희석배수의 colony 수 Colony수 계산 방법 세균수 10-2 10-3 10-4 1 TNTC 180 205 12 18 하나의 희석배수에 개의 colony가 있는 경우 ( )/2*103=192,500 1.9*105 2 245 230 32 30 두개의 희석배수에 25~250개의 Colony가 있는경우 (( )/2 x (32+30)/2*104)/2 =273,750 2.7*105 3 145 101 58 61 ( )/2*103 =123,000 1.2*105 4 20 전 배지가 25개 이하의 Colony가 있는경우 3*103 = 3,000 -> < 3,000 < 3.0*103 5 520 430 전 배지가 250개 이상의 Colony가 있는경우 ( )/2*104 =4,750,000 -> > 4,800,000 > 4.8*106 6 전 배지에서 Colony가 없는 경우 < 1.0*102 TNTC : Too Numberous To Count (균수가 측정 불가능할 정도로 많은 경우)

52 생균수 측정(현미경법) haemocytometer 혈구계수기(haemocytometer)를 이용하여 현미경으로 계수 함.

53 생균수 측정(현미경법) 0.2*0.2*0.1=0.0004mm3 1mm

54 생균수 측정(현미경법) 균수 측정 방법(1칸) 혈구계수기의 한칸의 부피 0.004mm3 1ml = 1ml3 = 1000mm3
0.004mm3 : 1000mm3 = x : 1ml -> x=4*10-6ml 총 25개의 칸 중 임의로 10개 정도의 평균 값을 구함 CFU = 1칸의 평균 생균수 * 희석배수 / 4*106ml 균수 측정 방법(25칸) 0.1mm3 : 1000mm3 = x : 1ml -> x=10-4ml CFU = 25칸의 생균수 * 희석배수 *104ml

55 배양중의 물질생산 – 1차대사산물 증식관련형 물질생산 세포의 증식과 물질 생산이 동시에 이루어짐 – 대수증식기에 생산
기질 소비속도, 세포증식속도 및 물질 생성속도 전부다 비례한다. 미생물의 생명유지에 필수적인 – 아미노산, 핵산, 단백질, 지질 등 생산 속도 탄소원소비 균체증식 물질생산 시간

56 배양중의 물질생산 – 2차대사산물 미생물 2차대사산물 고초균 Iturin, surfactin, bacillomycin 등
증식 비관련형 물질생산 세포의 증식이 끝난 후 물질의 생산이 시작됨 즉 대수증식기 후기에 물질 생산이 시작되어 주로 정지기에 이루어짐 세포의 증식속도와 물질 생산속도간에 직접적인 관계는 없음 항생물질 및 각종 분해효소 등을 생산한다. 균의 종류 및 배지의 성분에 의해 대사산물의 생성이 결정 됨. 미생물 2차대사산물 고초균 Iturin, surfactin, bacillomycin 등 유산균 Bacteriocin(항균물질), protease 등. 방선균 Streptomycin, cephamycin, kanamycin 등 광합성균 ALA, chlorophyll 등

57 배지와 균주의 상관관계 1 – 길항력 Bacillus subtilis Clear zone
동종의 균주일지라도 배지의 구성성분에 따라 길항력 차이가 크다. Clear zone 대사산물 생산용 배지 균주 성장용 배지

58 Bacillus thuringiensis
배지와 균주의 상관관계 – 2차대사산물 생성 Bacillus thuringiensis 배지 성분의 차이에 따라 균의 수와 내독소단백질의 차이가 보인다.

59 균주 분리 방법 1ml 1ml 1g 시료 10-1 10-2 10-3 배지에 100ul 도말 배양 80도, 30분간 가열
배양 후 colony 마다 streak 후 균을 분리 한다. 배지에 희석액 100ul를 뿌리고 도말한다. 배지는 다양하게 선택 사용 시료는 흙, 음식, 물, 식물 어떤 것이든 상관 없다. 물 9ml에 시료 1g을 첨가하여 vortexing 후 다시 2번 희석 한다. 온탕수조에서 희석액을 가열하여 부생균을 살균한다.

60 토양 분리 균주 확인 30도, 2일 배양 후 영양원을 소량으로 함

61 프로테아제 반응 실험 Skim milk 1%(1g)을 물 50ml에 완전히 녹인다. 녹인 Skim milk를 중탕한다.
Protease 반응 Skim milk 1%(1g)을 물 50ml에 완전히 녹인다. 녹인 Skim milk를 중탕한다. Skim milk와 TSA 50ml를 각각 autoclave에 멸균한다. 멸균 후 식으면 Skim milk와 TSA를 거품이 생기지 않게 섞어준다. 페트리디쉬에 배지를 분주한다. 배지가 마르면 균주를 Streak한 후 30 ~ 37도에 배양한다. Clear zone을 확인한다.

62 단백질 기질로 skim milk를 사용 단백질의 펩타이드 결합을 분해 연육제, 가죽제품의 가공, 치즈제조, 세제첨가용 및 소화제 등으로 이용 Skim milk 분해되어 알갱이가 없음

63 아밀라아제 반응 실험 물 100ml에 전분 0.5%와 TSA 4g을 녹인 후 멸균 한다. 멸균 후 페트리디쉬에 분주한다.
실험 방법 물 100ml에 전분 0.5%와 TSA 4g을 녹인 후 멸균 한다. 멸균 후 페트리디쉬에 분주한다. 배지가 식은 후 Streak하여 30 ~ 37도에 약 2일간 배양한다. Iodine/potassium iodide 용액을 뿌려 염색을 시킨다. Clear zone을 확인한다. 전분은 청자색을 보이며 반응이 일어난 부위는 흰색으로 보인다.

64 아밀라아제 반응 실험 청자색 : 전분 + 요오드 결합 아밀라아제 효소에 의해 전분이 분해된 부분은 흰색을 보인다.
아밀로오스 : 청색 아밀로펙틱 : 보라색 찹쌀녹말 : 적색

65 셀룰라아제 반응 실험 carboxyl methyl cellulose를 1%를 첨가하여 TSA배지를 만든다.
실험방법 carboxyl methyl cellulose를 1%를 첨가하여 TSA배지를 만든다. Streak하여 30~37도에서 1 ~ 3일간 배양한다. Congo red 0.2%를 20~30분간 배지위에 뿌려 반응 시킨다. 염색약을 버리고 1M NaCl을 뿌려 30분간 탈색한다. Clear zone을 확인한다. carboxyl methyl cellulose를 1%를 첨가하여 배지를 멸균한다. Trypan blue 1%를 분주할 때 첨가하여 넣어 배지를 만든다.(파란색) 배지가 마른 후 streak하여 반응 하면 clear zone이 생긴다.

66 셀룰라아제 반응 실험 붉은색 : 셀룰로오스 + congo red
미생물에 의해 셀룰로오스가 분해된 주위는 clear zone을 보인다.

67 카탈라아제 반응 실험 고체배지에 배양된 균을 일정량 슬라이드글라스에 올려 놓는다.
실험방법 고체배지에 배양된 균을 일정량 슬라이드글라스에 올려 놓는다. 과산화수소를 한방울 떨어뜨려 거품이 생성되는 정도를 확인한다. 균을 TSB 또는 LB, NB에 일정시간 배양한다. 페트리디쉬나 슬라이드 글라스에 배양액 0.5ml을 떨어뜨린다. 과산화수소를 1ml 떨어뜨려 거품의 발생정도를 확인한다.

68 카탈라아제 반응 실험 negative positive 과산화수로를 물과 산소로 분해하기 때문에 거품이 발생한다.
유산균의 배양 중 고초균의 오염여부를 확인하는데 이용할 수 있다.