현미경의 종류와 기능 광학현미경(light microscope) 위상차현미경(phase contrast microscope)

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1 현미경의 종류와 기능 광학현미경(light microscope) 위상차현미경(phase contrast microscope)
편광현미경(polarizing microscope) 형광현미경(fluorescence microscope) 투과전자현미경(Transmission electron microscope) TEM 주사전자현미경(Scanning electron microscope) SEM

2 광학현미경(light microscope)

3 위상차현미경(phase contrast microscope)

4 편광현미경(polarizing microscope)

5 형광현미경(fluorescence microscope)

6 투과전자현미경(Transmission electron microscope) TEM
생물절편 같은 엷은 시료를 전자선(electron beam)을 전자렌즈 (electron lens)로 확대하는 현미경

7 주사전자현미경(Scanning electron microscope) SEM
가는 전자선을 시료에 조사하면 시료로부터 2차전자 등이방출.이 전자 프로브를 음극선관(CRT)위에 밝기의 변화로서 상을 나타내는 장치

8 1. 전자현미경 검사 ◈ 광학현미경→ micron(㎛) 단위의 크기 내 관찰 기능, 미세구조 관찰불가
  ◈ 전자현미경→분해능이 수 nanometer(nm)   ◈ 전자현미경은 filament, 즉 음극선에서 전자기 방출→진공관속을 통과→ 공기중의 산소나 질소       원자와 같은 물체에 충돌하지 않고 고속으로 움직임   ◈ 전자는 음극선과 코일에 의해 발생하는 자장(magnetic fields) 속을 통과→전자의 흐름은 직선       이며 광선보다 훨씬 파장을 가짐. 검체(물체)를 통과한 전자는 최종적으로 전자현미경의 형광  screen이나 감광판에 나타남

9 • 표본제작단계에서 오염될 수 있는 인공산물을 최대한 방지
전자현미경관찰용 검체표본 • 초박절편(두께 50~60nm)으로 제작      • 검경시 고진공(10-5 torr 이하) 상태에서 관찰      • 검체의 자가융해문제에 더욱 신경써야 함   • 표본제작단계에서 오염될 수 있는 인공산물을 최대한 방지

10 광학현미경과 전자현미경비교

11 TEM과 SEM의 원리비교

12 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM)
  ◈ 광학현미경과 달리 광선 대신에 전자선을 이용→ 유리렌즈 대신에 철과 코일로 만든 전자렌즈 사용   ◈ 전자선이 고진공 상태에서 초미세박절편(ultrathin) 에 조사되면 전자선이 흡수, 산단, 투과되어 형광판에 맺힌 상을 관찰   ◈ 초미세박절편은 염료가 아닌 중금속을 침투시켜 흑백의 콘트라스트를 높여줘야 함   ◈ 분해능→ 0.2~0.3nm

13 투과전자현미경 표본제작 순서 시료의 채취와 세절(removal of specimen and sticing)
시료의 채취와 세절(removal of specimen and sticing)        시료 위에전고정액을 적셔 즉시 1㎣ 크기로 세절 전고정과 수세(prefixation and washing)           󰀻 4℃의 2.5% glutaldehyde(pH 7.4)에 고정 후 완충액으로 수세 후고정과 수세(postfixation and washing)           󰀻 4℃의 1.0% Osmium tetroxide(pH 7.4)에 고정 후 완충액으로 수세 탈 수(dehydration)           󰀻 하강계열 알코올(50→100%) 치 환(substitution)           󰀻 propylene oxide, 15분(실온, 교반) 침 투(infiltration)           󰀻 propylene oxide/epon(1:1), (1:2) 2회, 각 30분(실온, 교반) 포 매(embedding)           󰀻 epon mixture, 35,45,60℃ 삭 정(trimming)           󰀻 이등변 사다리꼴 준초박절(semithin sectioning)           󰀻 1㎛, 유리슬라이드 위에 부착, toluidine blue염색 및 광학현미경 관찰 초미세박절(ultrathin sectioning)           󰀻 50~60㎚, grid mesh 위에 부착 전자염색(electron staining)           󰀻 uranyl acetate와 lead citrate 이중염색 -관 찰(observation)-사진제작(photography) 판 독(interpretation)

14 투과현미경 표본제작과정

15 투과현미경 표본제작과정

16 시료채취 및 세절 ◈ 전자현미경용 시료; 채취 후 신속히 처리하여 인공산물 없이 세포가 온전하게 보존된 시료이여야 함→ 시료채취 후 고정까지 시간을 가능한 1~2분 이내로   ◈ 고정액은 얼음으로 채운 petri dish내에 냉각하여 두고 고정액을 시료 위에 떨어뜨려 가면서 건조 방지   ◈ 세절용 면도날을 2개 준비하여 acetone을 충분히 탈지 후 고무판이나 파라핀 위에서 조직을        각각 반대방향으로 당기면서 1㎣이하로 작게 세절→ 세절 시 필요이상의 힘이 조직에 가해지 지 않게 주의   ◈ 조직에 따라서 관류(perfusion) 또는 침수(immersion)하여 고정한 후 세절하기도 함   (3) 고정    ◈ 약 1㎣크기로 세절한 시료를 목적에 따라 각종 고정액에 고정   ◈ Glutaraldehyde 등의 전고정액에 넣을 경우 5㎣정도의 크기로 잘라 일단 20~30분간 고정 후       1㎣ 크기로 다시 세절(그림 24-3)

17 조직편의 고정과정

18 전고정(Prefixation)  ◈ Glutaraldehyde[(CHO(CH2)CHO)], paraformaldehyde[(CH2O)2], formaldehyde[HCHO] 등의 알데하이드계 고정제가 흔히 전고정액으로 이용→ 0.1M phosphate buffer 또는 0.1M cacodylate buffer에 녹여 pH 7.2~7.4로 조정    ◈ 2.5% glutaraldehyde를 가장 많이 이용     • 10㎖ 정도의 병에 담아 4℃에서 2~3시간 고정

19   후고정(postfixation) ◈ 2.5% glutaraldehyde 전고정 후→ 동일 완충액으로 2~3회 수세후→1% osmium tetroxide(Os4)에O 옮겨 4℃에서 1~2시간 고정 후→ 동일 완충액으로 수세후 다음 단계로 이동  ◈ OsO4→자극적 냄새, 유독 눈이나 코점막 손상→hood 장치 하에 취급, 피부접촉 금지, 비닐 장갑 착용    ◈ 만일 10% 포르말린에 고정된 시료를 전자현미경 표본제작 에이용할 경우→1㎣ 이하로 세절 하여 하룻밤 수세후 OsO 넣어 약간 깊게 흑갈색을 될 때까지 재고정    ◈ 조직보존을 위해서 고정액을 교반하면서 고정하는 것이 좋음    ◈ 고정액의 pH, 삼투압을 적정하게 유지    ◈ 지나친 고정→세포의 미세구조에 인공적 변화 발생

20 탈수와 치환 ◈ 고정이 끝난 시료→ 완충액으로 수세 후→시료 내 침투되어 있는 수분과 고정제를 탈수제로 치환하여 제거
◈ 탈수제(ex: ethanol, acetone)는 조직변화 방지를 위해 저 농도→고농도로 이동→탈수후 수지 포매를 위해 propylene oxide로 치환       50% alcohol(5분)→60% alcohol(5분)→70% alcohol(5 분)→80% alcohol(5분)→90% alcohol(5분)→95% alcohol(10분)→100% alcohol 30분(1단계 5분, 2단계 10분, 3단계 15 분)→absolute ethanol-propylene oxide 동량 혼합액(15분)→propylene oxide I(10분)→propylene oxide II(10분)  * 위의 과정을 EM 자동침투기로 실행 시→ 탈수, 치환과정에서 발생할 수 있는 인공산물을 최소화 하는데 효과적

21 포매와 중합 1  ◈ 포매제로 비수용성의 에폭시수지(eposy resin), 폴리스텔렌수지(polystulen resin), 스틸렌수지 (stylene resin)이용→ 주로 에폭시수지 이용   ◈ 에폭시수지→중합 후 수축이 적고 기포가 생기지 않으며 경화가 일정하게 진행되어 전자선에 대해 강함   ◈ 에폭시 혼합액 사용(표 24-1); 교재 p453참고    ※ A액은 연하고, B액은 경함, 온도조건에 따라 A액과 B액에 조절하여 사용. 여름철에는 오래된 것은 갈색을 띄며 점도가 높고 기포도 잘 안 없어짐

22 포매와 중합2 ① 포매 (embedding) • 치환이 끝난 조직을 propylene oxide + epon 혼합액(1:1)
(2시)→propylene oxide + epon 혼합액(1:2) (overnight)→epon 혼합액(2~3시간)에 침투시킨 후, 시료병을 여지나 신문 지 위에 부어 조직에 묻어 있는 에폰을 제거 한 다음, gelatin capsule, beem capsule, 실리        콘 포매판(silicon embedding mold)을 이용하여 포매한다(P 454 그림 참고)  ② 중합(polymerization)       조직편이 가라앉고 labeling이 끝난 뒤 중합오븐기(polymerization oven)에 넣고 다음과 같은 순서로 온도와 시간을 조절하여 중합    * 60℃에서 오랜 시간 방치 시 epon수지가 너무 딱딱해지므로 시간을 지키고, 보존하거나 너무 경하면 50℃ 정도에 넣어 둠

23 방치 후 chrome sulfate가 함유된 세정용액에 담근 후 수돗물로 충분히 씻고, 증류수로 다시 씻고 건조시켜 사용
[포매중 주의 사항]  A. Epon 혼합이 얼마 안된 저장액을 황색을 띄며 점 도가 낮아 기포가 있어도 곧 없어지나, 오래 된 것은 갈색을 띄며 점도가 높고 기포도 잘 안 없어짐     B. 포매시 실온은 20~26℃, 습도는 50% 이하의 포매 room이 있으면 바람직    C. Epon812, DDSA, NMA, DMP-30은 desicator에 보관하면서 사용 DMP-30은 오염이 잘 되므로 사용이 오래 된 것이나 변색된 것은 폐기     D. 포매제가 묻은 유리기구는 acetone이 있는 용기에 넣어 2~3일 방치 후 chrome sulfate가 함유된 세정용액에 담근 후 수돗물로 충분히 씻고, 증류수로 다시 씻고 건조시켜 사용

24 박절 (CUTTING) b. 다이아몬드칼 : 고가, 널리 사용, 각도는 40~60° (약54° 정도) c. 미세박절기
 ◈ 포매와 중합이 끝난 시료를 50~60nm 두께로 초미세 박절    ① 도 구      a. 유리칼(칼날의 각도 45°)      b. 다이아몬드칼 : 고가, 널리 사용, 각도는 40~60° (약54° 정도)      c. 미세박절기      d. 그리드(mesh grid) : 초박절된 절편을 올려놓는 것으로, 파라핀절편을 유리슬라이드에 부착  시키는 것과 같은 역할(그림 24-13)

25 Cupper Grid mesh

26 • 박절면이 노출되도록 여분의 수지를 실체현미경하에서 면도날이나 전용 삭정기를 사용하여 사다리꼴이 되도록 함(그림)
  박절 실기  block trimming      • 박절면이 노출되도록 여분의 수지를 실체현미경하에서 면도날이나 전용 삭정기를 사용하여 사다리꼴이 되도록 함(그림)

27 박절 실기 b. 블록과 칼의 고정 • 블록을 앞면이 3~5mm 정도 나오게 고 정 • 시료면의 한 변이 칼날에 평행하게
박절 실기   b. 블록과 칼의 고정    • 블록을 앞면이 3~5mm 정도 나오게 고 정      • 시료면의 한 변이 칼날에 평행하게 되도록 조정한 후 칼을 단단히 고정      • 틈의 각은 5° 전후      • 모세관 피펫을 사용하여 물받이 내에 증류수를 주입하여 수면이 시료와 평행하도록 채움

28 박절 실기

29 초박절기(ultramicrotome)

30 Diamond Knife

31 Diamond Knife cutting

32 박절 실기

33 Ultra structure-TEM

34 EM-검경 가능범위

35 Kidney

36 Ultra section c. 초미세박절 받이 수면 위로 부유
     • 칼과 시료를 접근시켜 자르기 시작→절편이 연속적으로 박절되어 물 받이 수면 위로 부유      • 이중 일부절편을 준초박절편(semithin section)용으로 슬라이드에 취에 t oluidine blue로 염색하여 광학현미경으로 관찰      • 광학현미경 관찰 후 필요에 따라 다시 불록을 삭정한 다음 절편의 색이 회색~은색 또는 금 색을 띤 은색이 되도록 약 100nm 이내로 초미세박절편을 제작(표 24-2)      • 손상되지 않고 깨끗하게 박절된 절편만을 가는 털이 달린 막대로 모아 그리드 위에 올린다.      • 그리드는 시계핀셋(tweezer)으로 조심스럽게 잡아 절편을 떠올린다.      • 그리드에 묻어 있는 수분은 여과지 위에서 건조시킨 후 검경

37 표24-2. 절편의 두께에 따른 간섭색

38 Ultra staining [Uranyl acetate 용액]
 • Absolute ethanol 25㎖ + uranyl acetate 1.5g→ *갈색병에 넣어 하룻밤 방치하여 용해시키면 형광을 띤 황색용액이 됨→냉암소 보관시 1개월간 사용가능    * 이 염색액은 열 또는 빛에 분해되기 쉬우므로 갈색병에 넣고 밀봉하여 실온 보관→냉장보관시 더 오래 사용가능

39 Ultra staining [Lead citrate 용액]
• Lead citrate 1.33g + sodium citrate 1.76g + 증류수 30㎖→30분간 교반기에 진탕하여 녹 임→완전용액 후 신선한 1N NaOH 8㎖를 가하여 (젖빛색 용액이 ntorxn명) pH12로 조절 후잘 밀폐되 용기에 담아 냉암소 보관(2~3개얼간 사용 가능)

40 Ultra staining method <염색방법>
 <염색방법>    • Petri dish내에 파라필름을 깔고 그 위에 주사기나 모세관피펫을 이용하여 uranyl acetate 용액을 직경 5mm 정도 떨어뜨린다.→초미세박절편이 놓여 있는 면이 밑을 향하게 하여 그리드를 uranyl acetate 액 위에 부유시켜 15~30분간 염색→시계 핀셋으로 그리드를 잡고 비이커 위에서 증류수로 30초~1분간, 40~50회 수세→여과지에 그리드의 물기를 흡수시켜 건조→검경    • Lead citrate 염색법도 위와 동일 ; 단 염색시 공기중의(혹은 호흡으 로 인한) 탄산가스와 결합하여 lead carbonate 침전물이 생기지 않게 페트리접시 내에 NaOH를 깔고 탄산을 흡착시킴

41 Ultra staining method

42 주사전자현미경(Scanning electron microscope) SEM
◈ 주로 시료표면의3차원 미세 형태를 조사할 때 사용 lymphocyte

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44 SEM image

45 SEM image

46 SEM image

47 SEM image Breast Cancer Cell /Prostate cancer cells

48 SEM image trachea

49 SEM image

50 SEM image

51 SEM image Cancer Cells

52 TEM image

53 arabidopsis

54 TEM image Ebola Virus

55 TEM image Pseudomonas putida

56 TEM image Renal Corpuscle /nephrtis IV, TEM

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58 TEM image Glomerolus (kidney

59 TEM image Cortex, Medulla, and Renal

60 TEM image mitochondria overlaid by

61 TEM image red blood cell

62 TEM image plasma cell

63 TEM image HIV

64 TEM of HIV virus

65 TEM image Mammalian HIV TEM

66 TEM image

67 TEM image Chlamydomonas TEM

68 TEM image pneumoniae (a)TEM

69 TEM image Mycobacterium tuberculosis

70 TEM image E. coli (TEM x26,730).