RT-PCR (Real Time quantitative Reverse Transcription PCR)

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1 RT-PCR (Real Time quantitative Reverse Transcription PCR)
분자생물학실험 SUBJECT RT-PCR (Real Time quantitative Reverse Transcription PCR)

2 분자생물학실험 RT-PCR (Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction)

3 분자생물학실험 Real-Time qRT-PCR (Real Time quantitative Reverse Transcription PCR) Baseline: 3-15 cycle 정도의 PCR 반응 초기 단계에서 나타나는 형광 신호, noise 값. 이 baseline 의 설정은 정확한 CT 값을 결정하는데 영향을 미치므로 주의해서 설정. Threshold: baseline 보다 훨씬 증가된 신호. 통계적 의미를 갖는 신호 수준. 증폭신호의 증가 양상이 뚜렷하게 구분되는 시점. Ct(threshold cycle): threshold 와 접점을 나타내는 형광신호의 cycle 수 의미. Template 의 양을 측정하는데 이용됨. 이론상으로 두배 많은 양의 template은 ct 값이 1cycle 더 일찍 나타남. Threshold Baseline Cycle 수

4 분자생물학실험 PCR Materials & Method * Primer : SHR, SCR, ACT2 Sample1
Step Temperature Time cycles Initial denaturation 95℃ 1min 1 Denaturation 15s 30 Annealing 58℃ Extension 72℃ 10s/1kb Final extension 5min Template (cDNA) 3 ㎕ Primer FW/RV 0.5 ㎕ / 0.5 ㎕ 5X Buffer 2 ㎕ Taq polymerase 0.1 ㎕ D.W. 3.9 ㎕ Total 10 ㎕ Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 SHR SCR ACT

5 분자생물학실험 Samples : Col-0, shr-2, shr-6, scr-5 Materials & Method
-SHR(SHORT ROOT) -SCR(SCARECROW) Cortex(co) Endodermis(en) 두 유전자가 소실된 MUTANT 는 세포분열을 할 수 없어 나중에 cortex와 endodermis로 분리되어 분화하는 것이 불가능. scr : 남아 있는 단일 층은 cortex와 endodermis 모두의 특성을 나타내는 것으로 보아, 이 돌연변이체는 여전히 cortex와 endodermis 의 특성을 발현하지만, 별도의 층으로 분리는 못함. Shr mutant: scr 과 유사한 세포분열 결함을 나타낼 뿐만 아니라, 내피의 전형적인 세포 특성을 만들 수 도 없다. SHR Mrna 는 유관속주(stele) 에 국한되어 있긴 하지만 이것의 번역산물은 이곳에 국한되어 있지 않다. SHR 단백질은 보다 바깥의 인접한 층으로 수송되어 다른 유전자의 전사를 조절한다.

6 분자생물학실험 Result & Discussion
- 각각의 mutant background에서 유전자 발현정도의 차이를 비교해 봅니다. shr-2 mutant background에서 SCR의 발현이 낮게 나온 건 뒤에 설명. Point mutation이라 발현에는 문제가 없어 마치 기능이 소실되지 않은 양상의 band를 관찰 할 수 있습니다.

7 분자생물학실험 Result & Discussion SHR scr-5 SCR shr-2 shr-6 239(CAG->TAG)
앞의 발현양상 band 결과를 보면 shr-2 background에서 SCR 유전자의 발현이 낮게 나오는데, 이는 두 mutant중 shr-2가 null 이며, SHR이 SCR의 전사를 도와준다는 것을 의미합니다. Abrash et al. (2009) Developmental cell 16: 787 shr-2 shr-6 scr-5 0.1kb SCR ATG SHR 239(CAG->TAG) SHR, SCR은 transcription factor(TF) 로 알려져 있습니다. SHR은 mobility가 있어서 stele에서 endodermis쪽 으로 이동이 가능합니다. 이동 후 SCR에 binding하여 SCR의 Transcription을 돕습니다. scr-5 mutant는 point mutation이 일어난 loss of function plant입니다.

8 분자생물학실험 다음 실험 예비 레포트 Yeast two hybrid - Yeast transformation