chromatography CHROMATOGRAPHY: 색층분리, 흡착제를 사용하여 화학물질을 분리 검출하는 방법

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1 chromatography CHROMATOGRAPHY: 색층분리, 흡착제를 사용하여 화학물질을 분리 검출하는 방법
교과서 26-28장 관련

2 어떤 물질을 두 상에 대한 친화력차이를 이용하여 혼합물 중에서 단일성분으로 분리하는 과정
Chromatography 크로마토그래피란? 혼합된 시료성분이 이동상과 정지상 사이를 흐르면서 흡착, 분해, 이온교환 또는 분자크기 배제작용 등에 의해 각각의 단일 성분으로 분리되는 것. 분리, 정성, 정량, 정제 등의 목적에 이용됨. 어떤 물질을 두 상에 대한 친화력차이를 이용하여 혼합물 중에서 단일성분으로 분리하는 과정 Interaction Elution Abacbc aabcbc A Injection

3 크로마토그래피의 분류-1

4 크로마토그래피의 분류-2 크로마토그래피는 정지상과 이동상 평형의 방법에 따라 서로 다른 이름으로 분류된다

5 크로마토그래피의 원리 교과서 그림 (a)관 용리 크로마토그래피법으로 혼합한 A와 B를 분리하는 과정, (b) 검출기에 나타나는 신호(이를 크로마토그램 이라 한다). 고정상 이동상 묽힘현상: 칼럼에 처음 투입 할 때와 detector에 도달할 때의 농도차가 생긴다. 이는 detector의 띠 넓힘 현상을 유발한다.

6 칼럼의 중요성 혼합물 A와 B가 서로 다른 길이의 관을 통과할 때, 검출기에서 측정되는 신호특성. 분리를 위한 목적일 경우 긴 칼럼이 유리하다. 그러나 이 경우에도 띠 넓힘 현상은 피할 수 없다. 띠의 넓이는 일반적으로 FWHM으로 측정한다.

7 칼럼의 중요성- 혼합물의 분리를 개선하는 방법
분리가 되지 않는 가상적인 상태 용리조건을 변화하여 앞의 성분은 관 아래로 빠르게 이동, 뒤의 성분은 천천히 이동하게 만듦. “용질의 이동속도에 관한 이론” 띠 넓힘 속도가 감소되도록 관을 조절한다. 칼럼효율에 관한 기초이론 + “띠 넓힘 속도에 관한 이론” 교과서 그림 혼합물 분리를 개선하는 방법.

8 용질의 이동속도에 대한 이론-1 두 용질을 분리하는 관의 효율은 두 화학종이 용리되는 상대속도에 의존한다.
화학종의 이동상과 정지상의 평형상태가 중요 Gauss분포 분포상수(일종의 평형상수) A라는 성분이 이동상과 정지상에서 평형을 이룬 경우, 다음과 같이 간단하게 표시할 수 있다. 이때 평형상수는 다음과 같이 정의된다(일반적인 화학 평형상수의 정의와 같다). 화학평형 상수는 몰농도가 아닌 활동도로 표시한다. 분석물의 몰농도를 활동도로 고치기 위하여는 실지로 활동도계수를 감안하여야 하지만(부록2참고), 농도가 낮거나 비이온성의 경우 활동도 계수는 거의 1이므로 활동농도로 바로 변환이 가능하다. 이 경우 다음의 관계가 성립한다. Cs, CM은 부분농도의 의미를 가지므로, 두상에서 부피로 몰수를 나누어준 것과 같이 된다. ◊ 일반적으로 Cs는 CM에 비례하고, 위의 식이 성립하는 경우를 선형 크로마토그래피라 부른다. 이 경우 대칭형의 Gaussian 형의 신호가 검출기에서 관찰되고, 칼럼에 분석물이 머무르는 시간을 나타내는 머무름 시간은 분석물의 량에는 거의 무관하다. 분포상수는 상사이의 분배 즉, 분리에 영향을 미치는 중요한 변수로서 이동상과 고정상의 선택에 의하여 조절할 수 있다.

9 용질의 이동속도에 대한 이론-2  분배상수는 일반적으로 머무름 시간을 측정하여 구할 수 있다.
머무름 시간(Retention time, tR):관속에 샘플이 실제로 머무르는 시간. 머무름 시간은 다음과 같이 정의된다. 용질이 이동하는 평균 선형속도는(길이/시간) 분석물이 고정상에 머무는 시간 불감시간(샘플이 아닌 이동상 성분이 머무르는 시간) 이와 마찬가지로 이동상 성분(컬럼내 미지성분)이 이동하는 평균선형속도는 다음과 같이 정의된다.

10 용질의 이동속도에 대한 이론-3 부피흐름속도와 선흐름속도
관에서 용질의 이동속도는 실제로 전체부피가 흐르는 속도이다. 따라서, 선속도와 면적의 곱인 부피흐름 속도가 일반적으로 속도개념으로 사용된다. 원형관 관출구에서 선속도 실질적으로 충전된 관의 전체부피가 액체로 채워지지 않기 때문에 위 식은 다음과 같이 변형된다. 관의공극율: 전체관의 부피에서 액체가 채워질 수 있는 분율

11 용질의 이동속도에 대한 이론-4 머무름시간과 분포상수와의 관계
용질은 실지로 다양한 성분으로 구성되어 있으므로 한 개의 용질의 이동속도는 전체속도에 대한 개별용질속도의 분율 과 같다. 즉, (A) 제일 빨리 나온 성분속도  시간분율 1. 이동상에 있어서 시간 분율은 어느 한 순간에 이동상에 있는 용질의 몰수(질량 OK)를 관속에 있는 전체용질의 몰수로 나눈 것과 같다(평형이 될때까지 진행). 즉, 이동상에 있는 용질의 전체몰수(질량)는 이동상에 있는 용질의 몰농도(CM)에 그것의 부피(VM)를 곱한 것(slide8참고, nM=CM  VM)과 같다. 마찬가지로 정지상에 있는 용질의 몰수는 정지상에 있는 용질의 농도(Cs)에 그것의 부피(Vs)를 곱한 것과 같다. ‘1’에서 언급한 것 처름 분율로 나타내어야 하기 때문에, 결국 관전체의 용질의 몰수(이동상+정지상)에 대한 이동상의 용질의 분율로 나타내어야 한다. 즉, “한용질이 이동상에서 보내는 시간 분율”은 다음과 같이 된다. 주의: 몰분율 차이가 나면 평행이 될때 까지 계속 시간이 지나므로 결국 몰분율의 값은 시간과 관련있다. 따라서 식 ‘A’는 교과서 식(p694)은 잘못되어 있음. 새로운 교과서는 잘 되어 있음

12 용질의 이동속도에 대한 이론-5 앞의 식에서 26-8식의 유도 Kc 결론적으로, (식 26-8)
Retention factor로 정의됨 즉, 한 용질의 이동속도는 분포상수와 관련이 있고, 또한 VM, Vs를 관의 설계 시 적당하게 조정하면 이동속도의 조절이 가능하다.

13 용질의 이동속도에 대한 이론-6 유도는 필기하면서.
머무름 인자(retention factor): 용질의 특성이 이동 속도에 관련하는 정도로 관의 모양이나 부피흐름속도와 무관하다. 마티즈 타고달릴까? 벤츠타고 달릴까? 용질 A의 머무름인자(kA)는 다음과 같이 정의된다. 식 26-9) 여기서 KA는 용질 A의 분포상수이다(교과서 p694, 잘못 표기).  kA와 KA는 전혀 다른 개념임을 주의. 크로마토그램에서 kA를 알아내는 방법(26-12식). 유도는 필기하면서. 식 26-12)

14 용질의 이동속도에 대한 이론-7 선택인자: 두 화학종이 섞여 있을 때의 선택의 정도(상대적인 이동속도)로 다음과 같이 정의된다. 식 26-13) 여기서 KB, KA는 각각 더 강하게 칼럼에 붙잡혀있는 화학종 (B)의 분포상수와 더 약하게 칼럼에 붙잡혀있는 화학종 (A)의 분포상수이다. 이 값은 항상 1보다 크게 된다. 선택인자를 크로마토그램에서 알아내는 방법(식의 유도는 필기) 26-15 식) Report:선택인자와 머무름 인자의 분리개선에의 사용법(교과서 26D항, p 정리)

15 분리도의 개념 Resolution (분리도)
Detector Response - Resolution은 두 피크의 분리된 정도를 간단히 표시해 주는 값. WA와 WB가 커지면 분리도는 낮아지고 시간차( t)가 커지면 분리도가 커진다. w가 크지면(띄가 넓어지면) 분리도가 낮아진다.

16 칼럼효율에 관한 기초이론-1 띠 넓힘은 현상은 분리효율을 떨어지게 하는데 이는 칼럼의 특성과 관련이 있다.
 같은 차를 타고 같은 거리를 달릴때 고속도로와 비포장도로의 차이는? 일반적으로 크로마토 그램에서 하나의 피크는 다음과 같은 Gauss분포를 가지게 된다. 여러 분자들이 칼럼을 따라 내려갈 때 마구잡이 식으로 움직인 동작들이 모두 합쳐진 결과. 이 경우 측정값의 오차의 음의 값과 양의 값이 같은 비율로 존재한다. (교과서 695p 해설참조) 여기서부터는 관내의 농도가 낮아져 앞부분과 대칭형을 가지게 된다. 다음과 같이 봉우리가 분리되는 경우 실지로 분리가 불가능하다. 하나의 봉우리가 앞세우기와 꼬리끌기 피크로 양분되어 있다.분석물의 량이 너무 많을 경우 혹은 칼럼에 문제가 있을 때 나타나는 경우가 있다.

17 칼럼효율에 관한 기초이론-2 여기서 L은 관의 충전길이로 cm의 단위를 갖는다 관의효율성(p695)
 관 효율을 나타내는 정량적인 척도로서  단높이(plate height, H)와 단수(plate count, N)의 개념이 일반적으로 이용되며 이들의 관계는 다음과 같다. 참고) 단높이와 이론단수의 개념은 크로마토그래피 관을 불연속적이면서도 접촉해있는 무수히 얇은 층 즉, 이론단으로 이루어진 증류관으로 간주한 이론적 연구로부터 시작되었다. 여기서 L은 관의 충전길이로 cm의 단위를 갖는다  관의 효율은 단수가 크고 단높이가 작을수록 증가한다. 여기에서 단높이란 동일한 농도(특정목표농도)로 혼합물을 분리하는데 필요한 가상적인 칼럼의 높이를 의미한다.  단높이는 데이터를 반복 측정 하였을 때의 “거리”에 대한 데이터의 신뢰성을 나타내는 표준편차()와 가변도(2)과 직접관계가 있으며 (부록1참고, p881), 다음과 같이 정의한다(p696). 검출시간=>칼럼길이 (칼럼의 단위길이당 가변도) 실지로 가변도 대신에 표준편차를 사용함이 정확하지만 그러면 단 높이의 단위가 없어진다. 단 높이가 길이단위이기 때문에 가변도(길이2)을 사용하여야 양쪽의 단위가 같다 (차원해석적 정의). Gauss해석에 의하면 2 은 L에서(피크) 신뢰수준 5 %(=10%)안의 영역의미. 100%를 할 경우 약 6.4(표 a1-3, 886p) 로 정의되어야 하지만 그렇게 정의 할 수 없다(의미가 없기 때문, H의 단위문제). (p881)

18 Gauss분포도의 이해 100 %  3.29  꼬리 및 머리가 길 경우 해석이 어려움

19 칼럼효율에 관한 기초이론-3 N과 H의 실험적 측정(크로마토그램에서 읽기)
정의: 용질의 봉우리에 대한 “시간의 가변도”(변화 가능한 정도)를 2으로 표시하며(2과 구별을 위하여) 데이터의 거리에 대한(2)가변도와 다음의 관계가 있다. (속도에 대한 정의와 같다. 속도=거리/시간 이므로 시간=거리/속도 의 값) 신뢰도의 설정치 및 표준편차에 따라 달라진다(p887&표a1-3참고).”거리에 대한 표준편차” 신뢰도란 아무렇게나 데이터를 하나 뽑았을 때, 그 데이터의 범위가 측정 오차안의 데이터가 될 수 있는 확률을 의미한다. 따라서 표준편차 와 직접 관계 있다. 용질의 평균선형속도 가우스 분포도의 특징 다음그림에서 ‘W’의 길이는 데이터의 가우스 분포도의 면적특성에서 구할 수 있다 (p887, 앞 페이지). 이 그림에서 삼각형 부분의 넓이는 봉우리 전체면적의 약 96%정도이다. 앞 페이지에서 가우스 분포도의 신뢰도(곡선아래면적)가 95%일 경우 최대값에서 음과 양의 편차는 2이다. 따라서, 그림에서 가로축의 절편은 최대값에서 2에 있다고 할 수 있다. -2 2 단수(N)에 관한 유도(필기): 단높이와의 관계 (26-21식): 크로마토그램에서 단수 읽기

20 띠 넓힘 속도에 관한 이론-1  크로마토그래피 관의 일반적 효율표시법(단높이 일반적표기, 2상의 속도론적 고찰)
실지로 크로마토그래피의 효율은 복잡한 물리적 상호작용과 띠 넓힘 현상 등이 포함되어야 하며(단 이론 만으로는 설명불가) 이들이 포함된 관계식은 다음과 같다. 등식의 양쪽 단위가 같지 않다. 즉 등식은 성립하지 않는다. 경험식으로 각각의 항목이 관련이 있음을 의미한다. (26-23) 이식을 네덜란드의 화공학자인 van Deemter의 이름을 따서 van Deemter식이라 부른다. 여기서 H는 cm로 나타내는 단높이, u는 cm/sec로 나타내는 이동상의 선형속도, ‘A’,’B’,’C’는 각각 다중흐름통로(A), 세로확산(B) 및 상사이의 질량이동(C)과 관련된 계수이며, 질량 이동항은 정지상과 관련한 계수(Cs)와 이동상과 관련한 계수(CM) 로 나누어진다. 여기에서 각 항은 완전한 독립변수는 아니며, 서로에게 어느 정도 영향을 미친다. 단높이가 커지면 일반적으로 용질이 이동하는 길이가 길어져 띠가 넓혀지게 된다. , : 충진제의 성질에 따른 상수 수업 중간중간 이 식들을 살펴보기 바람 교과서 p697, 699 캡션 참고 (표 26-2, 26-3)

21 띠 넓힘 속도에 관한 이론-2 다중항로 항 ‘A’ 띠 넓힘 현상은 부분적으로 분자 혹은 이온이 충전관을 통해 나아갈 때 이 통로가 여러 가지로 다양하기 때문에 나타난다. 그림에서 의 용질이의 용질보다 빨리 검출기에 도착한다. 이는 용매의 속도보다는 입자의 크기 및 분포와 관련이 있으며, 입자의 크기가 증가하면 내부부피의 증가가 수반되어 단 높이를 증가시키게 된다. 세로 확산 항 ‘B/u’ 확산은 농도가 진한 매질 부분에서 묽은 영역으로 화학종이 이동하는 물질전달의 대표적 현상으로, 확산에 의한 이동속도는 두 영역의 농도차 및 화학종의 확산계수(Fick’s 1st Law, 표26-3)에 비례한다. 기체의 경우 확산계수는 온도(분자의 활동성)와도 관련있다. 분자의 확산속도가 빠른 GC 에서는 세로방향의 확산이 잘 알려진 띠 넓힘의 원인이다. 확산속도가 매우 작은 LC의 경우 이 현상이 중요하지 않다. ‘B/u’ 항은 이동상의 확산계수에 크게 의존한다(표26-3). 앞의 일반식 항에서 알 수 있듯이 이동상의 선형속도 ‘u’는 단높이에 반비례한다. 즉, 흐름속도가 빠를 경우 분석물이 칼럼 내에 머무르는 시간이 짧아지고, 이로 인하여 세로방향 확산은 적어지고, 따라서 크로마토그램에서 띠의 양쪽 가장자리로 확산이 일어날 시간이 짧아지기 때문이다. Report: Fick의 확산 제1법칙, 제2법칙의 수식의 의미

22 띠 넓힘 속도에 관한 이론-3 다음 그림은 GC와 LC에 있어서 이동속도가 단높이에 미치는 영향을 측정한 것이다.
그림 26-8 그림에서 단 높이가 GC와 LC에서 크게 다른 것은 두 이동상 속에서의 세로방향 확산의 상대적인 속도를 감안하면 이해된다. 일반적으로 기체에서의 확산계수가 액체에서의 확산계수보다 여러 차수 크다(동일속도의 경우, 위의 그림은 동일속도가 아님). 즉, “B/u”에 대한 단높이는 GC가 훨씬 크게 된다.. 즉 기체의 경우에는 띠 넓힘의 직접적인 원인이 확산이 될 수 있다. 단높이 데이터는 어떻게 구해지는가?:: 크로마토 그램 실험 데이터에서 계산된 값

23 띠 넓힘 속도에 관한 이론-4 정지상 질량이동 항 ‘Csu’
각 항목과 H를 바로 연관하여 이해 정지상 질량이동 항 ‘Csu’ 단 높이(H)는 정지상이 부동화된 액체이면 질량이동계수는 지지체 입자에 부동화된 막두께의 제곱(df2)에 비례하고(Fick’s 2nd law의 해, 막 두께가 넓으면 많은 질량이 막 안으로 이동하고 머무름 시간이 증가), 막내에서의 용질의 확산계수 Ds에 반비례한다(확산계수가 크면 빨리 이동함을 의미) . 즉, 두꺼운 막을 사용하면 분자들이 표면에 도달하는데 평균적으로 더 먼 거리를 이동해야 하며, 확산계수가 작으면 분자들이 더 느리게 이동하게 되므로 결과적으로 정지상 에서의 질량이동속도가 느려지고 최종적으로 단 높이는 증가하게 되어 띠 넓힘 현상이 나타나게 된다. 정지상이 고체표면이면 질량이동계수 Cs는 화학종이 흡착 또는 탈착 되는데 필요한 시간에 정비례 하며, 이 시간은 흡착 또는 탈착의 일차속도 상수에 반비례한다. 즉, 흡착 탈착시간이 길어지면 띠 넓힘 현상이 나타난다. 이동상 질량이동 항 ‘CMu’  이동상에서 일어나는 질량이동 과정은 너무 복잡하여 아직은 완벽하게 정량적으로 설명되지 못하고 있지만 정성적인 해석은 이루어지고 있다. 먼저, 질량이동계수 CM은 분석물의 이동상 내에서의 확산계수 DM에 반비례하게 단높이에 기여한다(정지상과 동일). 또한 충전 칼럼에서 CM은 충전물질의 입자지름의 제곱(dp2)에 비례한다입자가 크면 이동농도가 크다. 이동상 질량이동이 단 높이에 기여하는 정도는 질량이동계수 CM와 용매속도 자체의 곱 만큼이다(Cmu). 따라서 CMu 가 단 높이에 영향을 주는 알짜 기여도는 용매속도 u에 대하여 직선관계가 아닌 복잡한 의존성을 가지게 된다. 이들 두 질량 이동항은 모두 머무름 인자(k)의 함수이다 (표 26-3). 즉, k값이 커지면 단 높이가 커진다.

24 띠 넓힘 속도에 관한 이론-5 띠 넓힘을 줄이는 방법
충전칼럼에서 칼럼효율에 영향을 미치는 한가지 인자는 충전물을 구성하는 입자이다. 입자지름의 단 높이에 대한 영향을 나타내는 교과서의 데이터(그림 26-11, p701, 그림 28-2, p741)를 보면, 입자의 크기가 작으면 작을 수록 단 높이가 작아짐을 알 수 있다. 실험에서 띠 넓힘을 줄이기 위하여 샘플을 순간적으로 주입한다. 세로방향(관흐름의 수직방향) 확산속도를 줄이기 위해서는 관의 직경이 작은 것을 사용한다. 이동상이 기체일 경우 세로방향 확산의 속도를 낮추기 위하여 온도를 낮추어 확산속도를 감소시켜 조작한다. 다음그림은 식 26-23에서 각 항들이 단 높이에 미치는 영향을 나타낸다. 그림에서 단 높이가 최소가 되는 조작조건이 있음을 명심하자. ‘A’항은 큰 영향이 없다. 관의직경 및 충진제가 결정되면 결정됨 H  B/u + CSu + CMu H값을 작게 하려면 Csu와 Cmu값을 바꾸어야야 한다. 칼럼의 설계 H값을 최소로 만드는 조작조건이 있다. 그림 26-10(p. 700)

25 정량분석과 정성분석 정성분석: 칼럼 및 실험조건이 정해지면 칼럼을 통과하는 물질이 detector에 도달하는 시간은 그물질의 독특한 특성이다. 따라서, 특정한 순수물의 통과시간을 알면 혼합물에서도 그 물질은 비슷한 시간에 Detector에 도달하게 된다. 이를 이용하여 정성분석이 가능하다. 정량분석: 정량분석의 방법은 여러 가지가 있으나, 널리 사용되는 방법은 봉우리의 높이에 의한 방법, 봉우리 면적에 의한 방법 그리고 표준물에 의한 방법이 일반적으로 사용된다. 1. 높이에 의한 방법은 peak에 수직선을 작도하여 그 높이로서 농도를 아는 방법으로 신뢰도는 90% 이상이다. 2. 면적에 의한 방법은 최근에는 기기에 달려있는 적분기를 사용하여 실시되고 있지만, 데이터에서 직접 측정도 가능하다. 3. 표준물법은 미지의 시료와 농도가 비슷한 표준물에 대한 데이터를 기준으로 피크의 높이나 면적을 계산하는 방식이다.

26 Report: 1.선택인자와 머무름 인자의 분리개선에의 사용법 (교과서 26D항, p 정리, 자필만 인정함) 2. Fick의 확산 법칙수식의 의미