Restriction Mapping of Circular Plasmid DNA

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1 Restriction Mapping of Circular Plasmid DNA
생화학 실험 (2) 3주차 Restriction Mapping of Circular Plasmid DNA and Transformation of Ligated Plasmid DNA 담당교수 : 하 상 준 교수님 담당조교 : 홍 석 봉 조 교 이 수 영 조 교

2 1. Transformation of ligated plasmid DNA
2. Restriction Mapping of circular plasmid DNA

3 Transformation transformation Colony형성 지난 주 실험 이번 주 실험 Vector

4 Transformation Transformation이란? Competent cell이란?
- 외부 DNA를 숙주세포에 넣어주어 세포가 새로운 유전형질을 갖게 되는 것 - 약 75년 전 Pneumococcus에서 처음 발견된 이래 여러 bacteria에서 관찰 E. coli (Escherichia coli)에서는 초기에는 발견되지 않았지만, CaCl2로 처리한 다음 heat-shock을 가하면 transformation이 되는 것을 발견 CaCl2를 처리한 E. coli를 사용하고 있음 (competent cell) Competent cell이란? 정상적인 E. coli에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell CaCl2 를 처리하여 membrane의 (–)전하를 중화시켜 (-)전하를 띠는 DNA가 membrane에 잘 부착되도록 만듬 Heat shock (42 ℃)을 가하면 plasmid가 cell 안으로 들어가는 효율이 증가

5 Transformation

6 Materials 1. Ligated plasmid DNA, D.W.(negative control)
2. competent cell 3. 200ul micropipette 4. spreader 5. alcohol lamp 6. 42 ℃ Heat block 7. LB-Amp plates 8. ice box & ice LB/AMP plate : yeast extract Tryptone NaCl Agar Ampicillin (antibiotics)

7 Procedure Competent cell을 ice 속에서 녹임 (2-3 min)
Ligated DNA 10ul와 negative control 10ul을 competent cell에 넣는다. Ice 속에서 30분간 방치 42 ℃ Heat block에 samples을 넣고 90초 동안 heat-shock Ice 속에서 2분간 방치 LB 배지 200ul를 넣고, 37℃에서 15분간 incubation Spreading 37 ℃ incubator에서 plates를 뒤집어 colonies가 형성될 때까지 배양 (약 12~18시간)

8 Restriction Mapping of circular plasmid DNA
DNA segment 상에서 restriction enzyme 절단 부위들의 상대적 위치. 이러한 위치를 결정하는 과정을 restriction mapping이라 한다. 염기서열을 모르는 DNA에서 어느 부분에 어떤 제한효소로 잘리는 부위 가 있는지를 결정해서 그 DNA의 대략적인 모습을 나타나는데 쓰임.

9 Restriction Mapping of circular plasmid DNA
? Restriction Enzyme : EcoR I, Hind III, Xho I EcoR I bp Hind III bp EcoR I + Hind III bp bp EcoR I + Xho I bp bp Hind III + Xho I bp bp 4kb EcoR I Hind III Xho I

10 Electrophoresis(전기영동)
전기영동이란? 시료를 gel에 넣은 후 전기를 걸어서 시료의 각 성분이 크기에 따라 다르게 움직이는 성질의 차이로 분리하는 것. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하(-)를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극(+) 쪽으로 움직이게 됨. Agarose gel에서 DNA migration rate에 영향을 주는 factors 1) DNA molecule size 2) Agarose concentration 3) DNA의 conformation 4) Voltage 5) etc.

11 Materials 1. Unknown plasmid DNA 2. micropipette
3. Microcentrifuge tube (1.5ml) 4. (10x) restriction enzyme buffer 5. Restriction enzyme ( Xho I, EcoR V, Pst I ) → -20℃ 6. 37 ℃ water bath 7. (6X) agarose loading dye 8. DNA size marker 9. ice box and ice

12 Enzyme은 제일 마지막에 넣어준다. -> 1
Procedure Microcentrifuge tube에 mapping할 unknown DNA와 buffer, D.W를 다음과 같이 첨가하여 반응 혼합물을 만든다. (total volume : 10 ul) ① EcoR V ② Xho I ③ EcoR V+Xho I ④ Xho I+Pst I ⑤ EcoR V+Pst I EcoR V Xho I EcoR V Xho I Xho I Pst I EcoR V Pst I Unknown DNA ( 0.1 ug/ul) 2 Enzyme buffer (10X) 1 Restriction enzymes Enzyme은 제일 마지막에 넣어준다. -> 1 D.W. 6 5

13 Procedure # Restriction enzyme 다룰 때의 주의사항 ! 37 ℃에서 1시간 동안 reaction한다.
Enzyme reaction한 DNA fragment들에 (6x)agarose dye 2ul 넣고 agarose gel electrophoresis를 수행한다. reaction volume (10 ul) + agrose dye (2ul) = total 12 ul (DNA size marker도 loading한다.) # Restriction enzyme 다룰 때의 주의사항 ! Enzyme이 들어있는 tube의 아랫부분을 손으로 만지지 않는다. enzyme의 양은 total volume에 10%를 넘지 않는다. Tip 윗부분만 살짝 넣어서 enzyme을 딴다.

14 전기영동이 끝난 후 Gel을 EtBr Staining 후, UV 상에서 DNA band를 확인한 후 print – out 한다.
모든 DNA fragment가 gel 상에서 움직인 거리를 재고 크기를 알고 있는 DNA size marker와 비교하여 각각의 restriction fragment의 크기를 계산한다. 6. Restriction map을 작성한다.

15 Result # Restriction mapping # Transformation
1. restriction enzyme digestion한 DNA의 gel electrophoresis 사진 2. restriction map # Transformation 1. transformation 사진

16 Further Study DNA를 세포 내에 주입할 때 쓰이는 용어들로 transformation, transfection, transduction이 있다. 이들의 차이점은 무엇일까?

17 Report 제출기한 : 화, 수반(10월 2일) – 목 반(10월 6일) (늦게 제출 시 태도 점수 감점)
제출장소 : S405호 (유전체 손상 질병 연구실) 반드시 hand-writing 합니다. 인터넷 등 각종 자료를 그대로 인용하는 경우 감점합니다 자료 인용 시 반드시 Reference를 씁니다 본인의 학번과 이름을 반드시 기재합니다 미제출시 0점 처리합니다 기타 수업 및 레포트 관련 문의는 홍석봉 : (S405호, )