Mammalian cell culture Ⅱ

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1 Mammalian cell culture Ⅱ

2 01 실험 목적 Cell counting 세포의 수를 대략적으로 계산하여 실험에 이용하는 방법을 숙지하고 직접 실험하면서 주의할 점을 알아본다.

3 02 Introduction Cell counting
세포를 실험에 이용하기 위해서는 알맞은 세포 양을 일정한 양으로 plate에 분주하는 것이 중요하기 때문에 cell counting을 통해 정확한 세포 수를 파악한다. ● Hemocytometer ● Cell Counter

4 02 Introduction Hemocytometer 𝐴+𝐵+𝐶+𝐷 4 x 2 x 10 4 (cells/ml)
Cell counting 02 Introduction Hemocytometer Trypan blue staining 𝐴+𝐵+𝐶+𝐷 4 x 2 x (cells/ml) x dilution factor(ml) Total cells(cells)

5 Cell counting 02 Introduction Cell Counter

6 Cell counting 03 Materials & Methods 1. 기존의 배지를 제거하고 PBS 4 ml을 조심스럽게 넣고 가볍게 흔들어준다 2. PBS를 제거한 후 Trypsin-EDTA 0.5 ml을 넣고 2분간 incubation 3. 배지 4 ml을 더한 후 cell을 모아15 ml tube로 옮긴다 4. Room Temperature, 1000 rpm에서 2분간 centrifuge 5. Cell pellet을 제외한 상층액을 제거하고 새로운 배지 5 ml을 넣어 재혼탁한다 6. e-tube에 세포 10ul + Trypan blue 10 ul 를 섞어서 10 ul를 Hemocytomete에 분주한다 7. 현미경을 통해 Trypan blue로 염색되지 않은 cell(흰색)만 countin한다. 8. Total cells을 구하고 원하는 세포 수를 계산 할 수 있다 Clean bench, 배양할 세포, 배지, 6cm dish, PBS, Trypsin-EDTA, Water bath, Pipette, Tip, 15 ml tube, Incubator, Centrifuge, Trypan blue, Hemocytometer

7 Cell counting 03 Materials & Methods 1. 기존의 배지를 제거하고 PBS 4 ml을 조심스럽게 넣고 가볍게 흔들어준다 2. PBS를 제거한 후 Trypsin-EDTA 0.5 ml을 넣고 2분간 incubation 3. 배지 4 ml을 더한 후 cell을 모아15 ml tube로 옮긴다 4. Room Temperature, 1000 rpm에서 2분간 centrifuge 5. Cell pellet을 제외한 상층액을 제거하고 새로운 배지 5 ml을 넣어 재혼탁한다 6. e-tube에 세포 20ul + Trypan blue 20 ul 를 섞어서 20 ul를 slide 에 분주한다 7. Cell counter에 slide를 넣고 측정한다 8. Total cells을 구하고 원하는 세포 수를 계산 할 수 있다 Clean bench, 배양할 세포, 배지, 6cm dish, PBS, Trypsin-EDTA, Water bath, Pipette, Tip, 15 ml tube, Incubator, Centrifuge, Trypan blue, Cell counter

8 Counting(A+B+C+D)한 세포 수 와 Total cell의 수
Cell counting 04 Result Counting(A+B+C+D)한 세포 수 와 Total cell의 수

9 05 Discussion Q1. Trypan blue staining 원리
Cell counting 05 Discussion Q1. Trypan blue staining 원리 Q2. (A+B+C+D)가 400일 때 3*105cells를 얻기 위해 몇 ml이 필요한지 구하시오 (trypan blue staining O) Q3. Hemocytometer 계산법 중 104 를 곱해주는 이유는? 𝐴+𝐵+𝐶+𝐷 4 x x (cells/ml) 2주차+3주차 report -> 3월 23일 수업시간 제출

10 310호 507호 3:20 – 3:50 8조 3조 3:50 – 4:20 6조 2조 4:20 – 4:50 4조 1조