6장 대사산물의 생산 - 유기산발효 - 알코올발효 - 유기용매발효 - 아미노산발효 - 핵산발효 - 항생물질 - 생리활성물질

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1 6장 대사산물의 생산 - 유기산발효 - 알코올발효 - 유기용매발효 - 아미노산발효 - 핵산발효 - 항생물질 - 생리활성물질
- 고분자물질발효 - 효소

2 발효공학 _ 3강 6-4. 아미노산 발효 6-5. 핵산발효

3 6-4. 아미노산 발효 - 아미노산의 제조방법 1) 대두, 소맥을 염산으로 가수분해하여 분리정제 2) 화학반응에 의한 합성법
 - 아미노산의 제조방법   1) 대두, 소맥을 염산으로 가수분해하여 분리정제     2) 화학반응에 의한 합성법     3) 미생물과 효소를 이용하는 방법   - 1956년 아미노산 조미료에 널리 이용되는 MSG의 전구물질인 L-glutamic acid의 공업적 제법이 확립  미생물에 의한 아미노산 발효법에 의해 생산  1. 아미노산의 생합성경로 및 생산방법     1) Glutamic acid 계열     2) aspartic acid 계열     3) Lysin 계열     4) Pyruvate 계열     5) Histidin-serine 계열     6) 방향족 아미노산 계열     표 6.9, 그림 6-11

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5 6-4. 아미노산 발효 2. 아미노산의 생산방식 : 발효법, 합성법, 효소법, 추출법이 있으며
 2. 아미노산의 생산방식      : 발효법, 합성법, 효소법, 추출법이 있으며       - 주로 효소법을 포함한 발효법이 이용       - 일부 합성법과 추출법이 이용    1) 발효법과 효소법      ①직접 발효법       ㉠ 야생균주 이용         : 특정아미노산을 배지 중에 다량 생산, 축척하는 방법         : L-glutamic acid 만 공업화         : 표 6-10      ㉡ 영양요구성 변이주를 이용하는 방법          : 야생균주에 자외선, NTG(nitrosoguanidin 등 변이 유발제 처리로            영양요구성 변이주를 만드는 방법)          : Lysine, valine, alanine 등의 발효법           

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7 6-4. 아미노산 발효 ㉢ 아나로그 내성 변이주를 이용하는 방법 - 미생물의 발육을 억제
     ㉢ 아나로그 내성 변이주를 이용하는 방법         - 미생물의 발육을 억제            5-methyl tryptophan, S-aminoethyl-L-cysteine(AEC) 등           tryptophan, lysine을 생성, 축척         - 약제내성과 영양요구성을 동시에 갖는 변이주            Lysine, threonine, isoleusine, histidine, arginine 등   ② 전구물질을 미생물로 변환        - 전구물질 또는 화합물을 배지 중에 첨가해서 미생물을 배양하여 전환           Glycine  Serine        - a-aminobutyric acid, D-threonine을 첨가하여 isoleucine을 생산하는 방법

8 6-4. 아미노산 발효 ③ 효소법에 의해 전환하는 방법 : 효소반응에 의해 아미노산을 만드는 방법 Aspartase
  ③ 효소법에 의해 전환하는 방법       : 효소반응에 의해 아미노산을 만드는 방법                  Aspartase       Fumaric acid > Aspatic acid       : 그 외 Lysine, tryptophan, Cysteine, phenylalanine 등 제조

9 6-4. 아미노산 발효 3. Glutamic acid 발효
    - 다시마의 맛난 맛 성분 monosodium glutamate(MSG)  1908 Ikeda     - 소맥의 Gluten(단백질)을 염산으로 가수분해에 의해 생성     - 1957년 Kinoshita 등 세균에 의한 발효법이 개발         현재 가장 많이 이용         아미노산 생산량 1위로 총 생산량의 50%    1) 사용균주        - Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, B. Flavum, Microbacterium ammoniaphilum 등       - 공통된 특징           호기성, G+, 구형 또는 타원형의 단간균, 운동성이 없음, 비포자형,          비오틴 요구성, a-ketoglutaric acid의 산화능이 약함,          α-ketoglutaric acid의 환원적 아미노화 능력이 강함

10 6-4. 아미노산 발효   2) 합성경로      ① Glucose로부터 합성 (그림 6-12)

11 6-4. 아미노산 발효   2) 합성경로      ② 초산 및 n-dodecane으로부터 합성 (그림 6-13)

12 6-4. 아미노산 발효 3) 당질을 사용한 glutamic acid 발효
      : 우수균주의 배양특성, 배지(biotin, pH, NH4의 농도), 통기량, 배양온도 등        ① 탄소원         - 포도당, 설탕, 과당, 맥아당, xylose 등         - 공업적으로 당밀, 전분 당화액이 사용         - biotin의 함량이 많기 때문에 페니실린/계면활성제 또는 C16~C18포화지방산         - 초기 10%에서 유가배양에 의해 15%까지 증가      ② 질소원              - 아미노기 공급이 중요         - (NH4)2SO4, NH4NO3, HN4Cl등의 암모늄염과 요소가 사용, pH 조절에도 이용         - pH 5.5 부근에서 지나치게 암모니아를 첨가하여 glutamine이 생성      ③ 무기염         - 무기이온을 공급, K, Mg, Mn, PO4, SO4, Cl- 등         - Mn, K : 수득률, Fe : 생육에 영향을 미침

13 6-4. 아미노산 발효 ④ 생육인자 - Biotin  glutamic acid의 세포막 투과성과 관련
     ④ 생육인자         - Biotin  glutamic acid의 세포막 투과성과 관련             양이 많으면 생산성 감소, 적으면 축척이 안됨         - 당농도 10%일 때 2~5㎍/L      ⑤ pH   최적 pH 7~8 (산성이나 알카리  생육이 감소)      ⑥ 통기와 교반         - 호기적 조건에서 발효, 통기가 중요         - 산소가 부족 : 젖산, 숙신산으로 전환         - 산소가 너무 과량 : a-ketoglutaric acid으로 전환      ⑦ 발효온도         - 배양온도 : 30~35℃, 본 배양 : 30~48시간 배양                - 발효의 예 : 그림 6-14

14 6-4. 아미노산 발효 Urea는 질소원으로 공급  pH 를 유지하는 목적으로 이용

15 6-4. 아미노산 발효         - 탄소원으로 초산, 에탄올, 탄화수소 등이 이용하여 생산 (표 6-13)

16 6-4. 아미노산 발효         - MSG의 제조공정 (그림 6-15)

17 6-4. 아미노산 발효 4) Glutamic acid의 분리 및 정제 용해도, 이온교환수지, 흡착제 등이 이용
     용해도, 이온교환수지, 흡착제 등이 이용      ① 용해도를 이용하는 방법         - pH 1 이하로 하여 1/3 감압농축 후 NaOH를 이용하여 pH 3.2로 조정           : 석출  염산을 이용하여 재석출 (순도 95% 이상)         - Ba, Ca, Zn 등 금속이온과 결합하여 난용성염을 형성하여 분리      ② 이온교환수지에 흡착시켜 용출하는 방법          : 무기양이온이 다량 존재하므로 약산성 양이온수지를 이용하여 1차 제거하고 강산성 양이온 교환수지에 효율적으로 흡착용출          : 이온배제방식이 이용      ③ 흡착제를 이용하는 탈색          : 아미노산이 방향족을 제외하고 활성탄에 흡착되지 않는 성질을 이용            - 탈색을 위한 공정

18 6-4. 아미노산 발효 ④ 염산염으로부터 분리하는 방법 : 용매의 처리로 경비가 소요되고 결과적으로 생산단가가 높은 단점
     ④ 염산염으로부터 분리하는 방법          : 용매의 처리로 경비가 소요되고 결과적으로 생산단가가 높은 단점               ⑤ 잡균과 phage의 오염대책 (그림 6-16)          : 약제를 이용할 경우 약제감수성조사를 통하여 적절한 항생제를 선별          : phage의 흡착저해제 (polypxyethylene glycol monoester, Tween 20 등)

19 6-4. 아미노산 발효 3. Lysine 발효 ○ 곡류단백질에서 부족되는 필수아미노산 ○ 식ㆍ사료에 영양강화제로 이용
- 1958년 Corynebacterium glutamicum의 hormoserine 요구성 변이주를 이용하여 생산 - threonine + methionine 감수성 변이주, - Lysine analog 내성 변이주 - 전구물질 또는 DL-lysine을 화학적 합성법으로 합성  효소 L-lysine을 형성 1) 변이주를 이용한 직접 발효법 : Lysine이 직접 생성 및 축적, 사용 균주의 종류에 따라 3종으로 분류 ① 영양요구성 변이주     (hormoserine 요구성 변이주, threonine+methionine 요구성 변이주) ② Threonine, methionine 감수성 변이주 ③ Lysine analog 내성 변이주

20 6-4. 아미노산 발효 1) 영양 요구성 변이주     : Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum의 hormoserine 요구성 변이주를 이용하여 생산     : 대사제어과정 그림 6.17

21 6-4. 아미노산 발효     : Lysine, threonine이 공존에 의해 저해되는 Concerted feedback inhibition 에 의해 aspartokinase에 의해 작용     : 조건, Biotin이 충분히 존재하고 homoserine 첨가에 의해 lysine 생성ㆍ축척     : 탄소원 - 사탕수수당밀, threonine, isoleusine, methionine 등            부원료(탈지대두박 가수분해물, 단백질 가수분해물)     : Biotin  사탕수수당밀에 충분, 30㎍/L이상 함유     : 생산수율 (30~40%)     : 다른 탄소원 - Acetic acid, ethanol, n-alkane 등     : 회수방법               산성  강 이온수지(NH4)에 흡착  암모니아수로 용출  감압농축             pH4로 조절 감압농축에 의해 석출  결정분리, 건조

22 6-4. 아미노산 발효

23 6-4. 아미노산 발효 2) Threonine, methionine 감수성 변이주
   : Brevibacterium flavum의 변이주    : threonine, methionine 소량 첨가하면 생육이 제해되는 감수성 변이주      → glucose를 이용 23%의 생산수율    → homoserine dehydrogenase 활성 저해 → threonine 생성 감소     → 균체 형성에는 지장이 없으나 aspartokinase 활성을 억제하지 못함     → Lysine의 과잉생산을 억제하는 threonine 생합성이 억제

24 6-4. 아미노산 발효 3) Lysine analog 내성 변이주
   : S-(β-aminoethyl)-L-cysteine(AEC, lysine의 analog) 내성 변이주     → glucose, 34g/L의 L-lysine을 생산     → threonine이 공존하면 생육저해작용     → Lysine의 첨가로 저해가 제거된다.     → analog의 존재시 threonine이 존재하여도 거의 영향을 받지 않음        aspartokinase 활성도 Lysine+threonine에 의해서도 저해받지 않음

25 6-4. 아미노산 발효 (2) 효소에 의한 Lysine 제조 합성법과 효소법을 결합
     합성법과 효소법을 결합                       → 두 효소의 최적 pH : 전자 8.0, 후자가 9.0     → 동결건조 균체와 Cryptococcus laurentii의 아세톤 건조균체 0.1%(w/v)첨가     → 40℃, 25시간 99.8% 전환율 (3) 유전자조작에 의하여 육종한 변이주를 이용하는 방법     1) 변이균주 (Lysine 생산↑, glucose 소비속도 ↓)                        +     2) 변이주 (Lysine은 생산 x, 당의 소비속도↑)                       ↓               세포융합에 의해 융합체 획득     → 짧은 시간 내에 70g/L의 생산수율

26 6-4. 아미노산 발효 4. 기타 아미노산 발효 1) Aspartic acid
    : Na, K염의 형태로 피로회복, 심장치료, 간장질환치료, 빈혈치료 등에 이용     : Phenylalanine과 함께 Aspatam의 원료 및 노화방지용 화장품원료    Fumaric acid + NH3 → L-aspartic acid                    aspartase     : Aspartase 생산균주       → Bacillus megaterium, E. coli. Pseudomonase fluorescence 등     : 효소나 균체를 고정화, 연속반응방법이 개발

27 6-4. 아미노산 발효 2) Phenylalanine : 방향족아미노산으로 아미노산 영양수액에 사용
    : 방향족아미노산으로 아미노산 영양수액에 사용     : peptid계 감미료인 aspartame의 한성분    식품용도로 이용이 확산                   phenylalanine transaminase     Phenylpyruvic acid →  Phenylalanine  (수득율, 10.9g/L, 전환율 78%)                  phenylalanine ammonia lyase    Phenylsuccinate + HN3 → Phenylalanine (수득율, 28.g/L, 전환율 80%)     : Brevibacterium lactofermentum의 변이주       → glucose을 탄소원으로 하여 25g/L의 수득율     : Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, E. coli의 형질전환주       → glucose을 탄소원으로 하여 30~40g/L의 수득율

28 6-4. 아미노산 발효 3) Threonine : 미생물에 의해 L-threonine 만이 생성
  ○ E. coli의 아미노산 다중 요구주        → Diaminopimelic acid-+methionine-+isoleusine-,        → Methioninine- + Valine-     : α-amino-β-hydroxy valeric acid 내성주의 아미노산요구주        Methionine-, isoleucine-     : 과당, 포도당등을 탄소원으로 하여 6~14g/L threonine 생산    ○ Corynebacterium 속, Brevibactererium 속 등     : glutamic acid 생산균주로부터 유도된 내성균주        10% 포도당함유배지 → 10~14g/L 생산     : Methionine 요구주        18g/L의 L-threonine을 생성

29 6-4. 아미노산 발효 유전자조작기술 O 세포융합 = L-threonine + lysine 동시 축척 + threonine 저, lysine 요구변이주 = threonine  18g/L O 유전자 조작 E.coli K-11  bIM4  plasmid DNA(PA1294-thr+)  형질전환  NO.29-4 (60g/L의 수율)

30 6-4. 아미노산 발효 (4) Tryptophane (필수 아미노산, 수액) o 효소나 미생물에 의한 전환기술
- Anthranillic acid, Indole 등 전구물질 o DNA기술 효소/균체 고정화기술/재조합 DNA기술  E.coli의 Tryptophane synthetase 활성 230배 증가  78 g/L 수율 o 미생물에 의한 발효 : 전구물질 고가  저가의 포도당/당밀을 이용

31 6-4. 아미노산 발효

32 6-5. 핵산 발효 6-5. 핵산 발효 : 가다랭이 표고버섯의 맛난 맛의 주성분
→ 5‘-nucleotide(IMP, GMP 등),  Na+-glutamic acid(MSM) → 공업적 적용 ○ 생산방법      1) 효모 RNA 분해법      2) 미생물의 변이주 이용 직접발효      3) 발효 + 유기합성 ○ 정미성 nucleotide 산업발전       → 생합성, 상호변환, 대사제어방법 등

33 6-5. 핵산 발효 1. nuclotide 의 화학적 구조와 정미성 o 핵산 = DNA + RNA
         = 염기 + 당 + 인산의 polynucleotide o 정미성을 갖기 위한 화학구조 1) 고분자  nucleotide, nucleoside 및 염기중에서 mononucleotide만 정미성이 있다 2) 염기가 purine 계의 것만이 정미성이 있다. 3) purine 환의 6‘위치에 OH기가 있어야 한다. 4) Ribose 의 5‘ 위치에 인산기가 있어야 한다.

34 6-5. 핵산 발효 1. nuclotide 의 화학적 구조와 정미성
o 우수한 정미성 물질 = guanylic acid, inosinic acid, xanthylic acid  맛의 세기 GMP>IMP>XMP  MSG 와 혼합 → 맛의 상승효과  nucleotide와 MSG의 혼합조미료가 생산

35 6-5. 핵산 발효 2. 정미성 nucleotide의 제조 ○ 천연생산물 : 어류(전갱이 등), 통조림폐액, 멸치, 오징어 등
○ 합성생산물      1)  RNA를 5‘phosphodiesterase나 화학적으로 분해하는 방법(RNA 분해법)     2)  purine nucleotide 합성의 중간체를 배양액 중에 축적시킨 다음          화학적으로 인산화하여 nucleotide를 합성하는 방법(발효와 합성의 결합법)     3) 생화학적 변이주를 이용하여 당으로부터 직접 nucleotide를 생산하는 방법         (de  novo 방법)

36 6-5. 핵산 발효 (1) IMP 제조 1) RNA 분해법 주요공정 1) 효모균체의 제조와 RNA 추출
    주요공정     1) 효모균체의 제조와 RNA 추출   2) 5 ‘phospho diesterase 생산     3) RNA의 5‘phospho diesterase에 의한 분해     4) 분해액으로 부터 5 ‘nucleotide류의 분리, 정제    그 외  RNA 화학적 분해법      : 효소대신 알칼리로 분해  nucleoside를 화학적으로 인산화

37 6-5. 핵산 발효 (1) IMP 제조 1) RNA 분해법 ① 효모액의 제조와 RNA 추출
   ㉡ DNA가 RNA에 비하여 적으며    ㉢ 균체의 분리회수가 용이  ㉣ 아황산펄프액, 당밀, 석유계 물질 등 값싼 탄소원을 이용할 수 있는 장점 - RNA 생산량 (그림 6.29)     대수 증식기 중간에서 RNA 함량이 최대 → 이때 회수 - 회수공정    균체수확  물로 세척  식염수, 묽은 NaOH로 추출  원심분리 균체 잔사제거    산성 또는 에탄올이용 침전  탈수 건조  NaOH에 녹여 분무건조 (Na염  획득)

38 6-5. 핵산 발효

39 6-5. 핵산 발효 ② 5‘phospho diesterase 생산 o RNA  RNA 가수분해  mononucloetide
   o 정미성을 갖기 위해 ribose에 5위치에 인산이 결합         → 5‘phosphodiesterase을 이용

40 6-5. 핵산 발효 ③ RNA 분해와 5‘ nucleotide의 분리정제 RNA 정제품을 얻기 위해서는 가수분해 반응후
     RNA 분해효소인 5-nuclease, phosphomonoesterase의 활성을 억제   예) Penicillium citrinum         : 온도의 구분에 의해 phosphomonoesterase를 억제            5‘phosphodiesterase (65℃)  phosphomonoesterase(45℃)         : phytin은 phosphodiesterase의 활성을 억제  pH 5, 10℃, 20 hr 반응 → 제거         : RNA 분해  pH 5, 65℃, 4 hr 반응 → 제거         : 정제 (정미성의 purine 계열만을 얻기 위한 목적)            이온교환수지, 활성탄을 이용            IMP, GMP를 획득

41 6-5. 핵산 발효 ④ 부산물의 이용 - 효모균체/pyrimidine 계열 RNA
        뇌장해 치료제, 유제품의 핵산첨가물, 항암제 등 의약품원료로 이용 ⑤ RNA의 화학적 분해     - 알카리분해 :  수산화칼슘 → 130℃, 3~4시간 가열 → 인산화 → IMP, GMP 획득

42 6-5. 핵산 발효 2) 발효법에 의한 inosine의 제조와 인산화 ① Inosine 발효
       : Bacillus, Brevibacterium, Microbacterium 등 야생균주  변이처리(X-선, 자외선 등)   영양요구주 획득

43 6-5. 핵산 발효 : Brevibacterium의 발효경과의 예(그림 6.32) : Inosine의 분리(그림 6.33)
         그 외에 알카리성 → 강 염기성 이온교환수지 처리 → insine 흡착 → 초산으로 용출           → 농축, 석출

44 6-5. 핵산 발효 ② Inosine의 인산화    - Inosine의 인산화 방법  화학적 방법 (phosphotransferase 이용)    - 화학적 방법       oxychloro-phosphate을 처리 → 2‘, 3’ 위치에 OH기 , 5‘에 인산화        가수분해 (isoprooylidene 기를 제거) → 80%의 수득율 (5’ IMP 획득)

45 6-5. 핵산 발효 3) 직접발효법 - IMP → 세포막 투과성이 나쁘고, 분해효소가 많아 축척의 어려움이 있음 - 해결방법
   - 해결방법     ① IMP분해효소 결여,   ② IMP 세포막 투과성 증대    - 균주 : Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium ammoniagnes                phospatase의 활성이 낮고               변이주는 직접 nucleotide를 축척 : 자외선, 돌연변이원인  NTG를 이용

46 6-5. 핵산 발효 생산예) Brevibacterium ammoniagnes
    : Mn2+의 농도를 엄격히 규제함으로서 세포막투과성에 변화     : 다량의 Mn이 있는 경우        - 항생물질 또는 계면활성제를 첨가하여 조절        - Mn이 존재하여도 IMP의 축척에 영향을 받지 않는 변이주 개발          (IMP 축척에 필요한  Zn, Fe, Ca에 대해서도 안정성) (2) GMP의 제조                 ①     IMP   ⇄ GMP                 ②      ① IMP dehydrogenase는 GMP에 의해 활성이 제어     ② 과량의 GMP가 존재시 GMP reductase에 의해 IMP로 전환 - GMP제조    ① 발효법에 의한 AICAR (5-amino-4-imidazol-carboxyamide ribotide)를 생산        합성법에 의해 AICAR로부터 GMP를 합성    ② 발효법에 의한 guanosine을 생산, 합성 또는 생화학적인 방법으로 인산화     ③ 두 종류의 균주를 혼합 배양하여 GMP를 직접생산

47 6-5. 핵산 발효 1) RNA 분해법 - IMP와 동일 2) AICAR 발효를 이용한 방법
① AICAR 발효 (5′-phosphoribosyl-4-carboxamido-5-aminoimidazole) - 히스티딘 생합성경로의 부산물로 생성 (SAICARAICAR, 아데닐로숙신산분해효소부터)       - 균주개량 (X-선, 자외선)       예) Bacillus megaterium No.336      - 공업적 생산에서 탄소원으로 전분당화액이 이용되고      - 배지 중 ㉠purine 공급원과 그 양, ㉡PO4량, ㉢K+ 량 ㉣아미노산     - 생산조건       :  Fe, Mn 등 금속이온, threonine 등 첨가 → 촉진           histidine 첨가 → 생산억제       : Purine 원 → 건조효모, RNA 첨가       : 포자형성 → 생산감소 →  억제제 (포화지방산, 계면활성제, 항생물질 등) 첨가       : 산소공급이 감소시 포자형성을 억제          그러나 ARCAR의 생산이 감소

48 6-5. 핵산 발효 ② AICAR 로 부터의 GMP 생산 ARCAR → 양이온 교환수지에 흡착 → 용리, 농축, 건조

49 6-5. 핵산 발효 3) Guanosine 발효법 ① Guanosine 발효
            : 생산균주 → Bacillus subtilis 이용             : Inosine 생산균주로부터 Guanosine 생산균주로 개량을 위한 과정 (표 6.20)                - 조절기구의 해제와 GMP reductase의 결여가 필수(이노신으로 전환억제)

50 6-5. 핵산 발효 ② Guanosine의 인산화 : 발효액으로부터 분리, 정제 (그림 6.37)  고함량의 구아노신 농축
           : 발효액으로부터 분리, 정제 (그림 6.37)  고함량의 구아노신 농축            : 인산화과정 IMP와 동일  5탄소에 인산을 결합하여 정미성 제공

51 6-5. 핵산 발효 4) 직접발효법 Brevibacterium ammoniagnes
   4) 직접발효법           Brevibacterium ammoniagnes           → 5‘ IMP생산균주로부터 유도된 5’XMP 생산균주           → 5‘-XMP를 5’-GMP로 전환하는 균주를 혼합배양          ① XMP 발효 ② 전환균배양 ③ 전환반응으로 구분                                                                               1차배양           XMP를 충분히 배양 후기 전환균을 생육 효율적인 전환  - 계면활성제 첨가  - 인산 저농도배지를 이용하여 인산전환을 조절  - casamino acid 2%첨가 전환촉진

52 기타 핵산관련물질의 생산  - 보조효소를 이용하여 각종 생리활성 nucleotide 유도체의 생산원료 및 의약용으로 이용