Section 1-8 박절 (Cutting).

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1 Section 1-8 박절 (Cutting)

2 Cutting (박절)

3 박절의 목적 조직을 현미경으로 관찰하기 위해 침투과정을 거쳐 만들어진 block의 조직의 내부구조를 정확히 볼 수 있도록 얇게 자르는과정 박절에는 박절기(microtome)가 사용되며, paraffin block의 경우 일반적인 표본제작에는 6±2 μm 두께의 절편이 적당 Cutting (박절)

4 Cutting (박절) 박절기의 종류 활주형 박절기 (Sliding microtome)
Knife 또는 paraffin block이 제한된 활주(slideway)를 따라 전후로 움직이며 박절하는 형식 크거나 단단한 조직의 박절 및 celloidin block의 박절에 좋으며 rotary microtome에 비해 비교적 얇은 절편을 생산할 수 있는 장점 연속절편(serial section)을 얻기가 어려워 일 처리가 느려 다량의 검체를 취급하는 큰 검사실에서는 적당치 않는 것이 단점 Cutting (박절)

5 Cutting (박절) 박절기의 종류 활주형 박절기 (Sliding microtome)의 종류 Jung type
Paraffin block이 경사진 활로를 따라 정해진 μm 만큼 이동하면서 위로 전진하면서 절편이 생산 Paraffin block 뿐만 아니라 celloidin block의 박절에도 효과적 Cutting (박절)

6 Cutting (박절) 박절기의 종류 활주형 박절기 (Sliding microtome)의 종류 Schanze type
칼은 평행한 활로를 따라 움직이며, paraffin block은 한 위치에 고정되어 나사 작용에 의해 상승되어 박절 Cutting (박절)

7 Cutting (박절) 박절기의 종류 회전형 박절기 (Rotary microtome) “Minot microtome“
큰 block이나 딱딱한 조직, celloidin block을 자르기에는 적당하지 않다. 연속절편(serial section : ribbon 형성)이 가능하여 다수의 블록을 신속히 처리할 수 있는 것이 장점 절편도 활주형에 비해 두껍게 절단되는 경향이 있다. Cutting (박절)

8 박절기의 종류 회전형 박절기 (Rotary microtome) Cutting (박절)

9 박절기의 비교 Cutting (박절)

10 Cutting (박절) 박절기의 종류 Rocking microtome
가장 단순한 박절기로서 60~90장의 긴 연속절편을 생산할 수 있는 장점이 있으나 사용상 불편한 점이 많아 널리 보급되지 못했다. Cutting (박절)

11 Cutting (박절) 박절기의 종류 동결용 박절기 또는 냉동박절기 (Freezing microtome)
사토리우스 박절기(sartorius microtome) 블록재물대가 측면에 구멍이 뚫려 있는 금속제 원반(metal disc)에 CO2 가스실린더와 관으로 연결되어 있어 실린더의 cock를 열면 액체 CO2 gas가 관을 따라 블록 제물대 원반의 구멍을 통해 분출하면서 조직편으로부터 기화열을 흡수하여 동결되는 원리 Cutting (박절)

12 Cutting (박절) 박절기의 종류 동결용 박절기 또는 냉동박절기 (Freezing microtome)
전기냉동박절기(cryostat) 밀폐된 냉동실 내에 회전형 박절기를 장착 냉동실 내의 온도를 일정하게 조절 또는 유지 (-20℃)할 수 있도록 설계 열추출기 (heat extractor) 원리로 신속한 열전도체를 이용하여 조직을 동결 Cutting (박절)

13 Cutting (박절) 박절기의 종류 초미세 박절기 (Ultramicrotome)
전자현미경 표본제작에 필요한 약 50~120nm (0.05~0.12μm) 정도의 초미세 절편을 생산 할 수 있게 특수 제작된 박절기 미세한 박절과정을 살피기 위해 저배율 쌍안 현미경이 박절기에 부착 block을 박절할 때는 포매제로 epoxy resin이 사용되므로 특수하게 제작된 유리칼(glass knife)이나 다이아몬드칼 (diatome)을 끼워 사용 Cutting (박절)

14 박절기의 종류 초미세 박절기 (Ultramicrotome) Cutting (박절)

15 Cutting (박절) Microtome knife 측면도에 따른 분류 Biconcave 형 Plano-concave 형
Plano-wedge 형 양 면이 평면 일반적인 paraffin block의 박절 및 동결절편용으로 조직검사실 에서 가장 널리 사용 Rotary, sliding, cryo-cut microtome 등에 모두 사용 Tool-edge 형 Chisel(끌, 조각칼) 형태의 칼로 매우 견고하여 plastic에 포매된 비탈회 골조직의 박절에 사용 Cutting (박절)

16 Microtome knife 측면도에 따른 분류 Cutting (박절)

17 Cutting (박절) Microtome knife 박절용 칼은 손잡이의 유무에 따른 분류
칼의 손잡이가 고정된 Heiffer knife 칼의 손잡이를 떼어 낼 수 있는 형태 ; 칼의 손잡이쪽 부분을 heel, 반대쪽 끝부분을 toe Cutting (박절)

18 Cutting (박절) Microtome knife Feather 형 (disposable blade)
knife holder에 삽입하여 Rotary, sliding, cryo-cut microtome 등에 모두 사용 사용 도중 날이 무디어지면 즉시 교환해 사용할 수 있으므로 항상 예리한 칼날 을 유지 Cutting (박절)

19 Cutting (박절) 칼의 연마 (bevel) 무디어진 칼을 숫돌에 갈아 칼날을 날카롭게 해주는 과정
연마가 끝나면 칼날의 끝을 xylene에 적신 헝겊으로 깨끗이 닦아낸 다음, 지지대에 칼을 올려 놓고 현미경으로 경검(100X)하면서 칼의 연마 정도를 관찰 칼날의 곡선 반경 0.1~1.0 µm 이내 Cutting (박절) Coarse graining Fine graining

20 Cutting (박절) 칼의 연마 (bevel) 쐐기각(wedge angle)
칼의 양 면이 경사를 이루어 한점에서 만날 때 칼의 양면이 이루는 각도로 약 15˚ plano-wedge 형 칼 마도각(bevel angle) 숫돌과 마찰되어 형성되는 각도 paraffin block의 박절과 깊은 관련을 갖게 되며 27~32˚ 자동마도기인 경우는 이 각도로 조절 Cutting (박절)

21 칼의 연마 (bevel) 쐐기각(wedge angle)과 마도각(bevel angle) Cutting (박절)

22 Cutting (박절) 칼의 연마 (bevel) 틈의 각(clearance angle)
Paraffin block의 박절면과 칼날 아랫면의 연장선 사이의 각으로 약 5~10°가 적당하며, 7°가 이상적 단단한 뼈조직과 섬유조직인 경우 각도를 15° 칼을 당기는 각(knife pull slope angle) 칼을 당길 때 마찰력을 줄여 박절을 쉽게 하기 위한 각 동결절편과 rotary microtome의 경우는 90°, paraffin 박절의 경우는 45° (sliding type), celloidin 박절의 경우는 35° Cutting (박절)

23 칼의 연마 (bevel) 틈의 각과 칼을 당기는 각 Cutting (박절)

24 Cutting (박절) 자동 마도법 자동마도는 항상 칼의 각도를 일정하게 유지
칼을 갈 때 일정한 힘이 가해지므로 편리할 뿐 아니라 갈린 정도도 우수 aluminium oxide와 같은 연마제(abrasive)를 발라서 사용 Coarse abrassive (거친 연마제) Fine abrassive (고운 연마제) 마도 후 칼의 검사 칼 검사대(knife inspection block) 위 에 칼을 얹어 넣고 현미경 저배율(100x)로 관찰하여 톱니모양의 흠이 없이 일직선에 가까워야 한다. 잘 연마된 칼은 일직선상으로 보이는 칼 끝이 0.1~0.3 µm의 미세한 원형의 경계선 Cutting (박절)

25 자동 마도기 Cutting (박절)

26 Cutting (박절) 박절시 필요한 기구 부유항온수조 (flotation bath)
박절된 paraffin 절편의 주름을 펴는데 사용 온수조의 온도는 paraffin의 융점보다 10℃ 낮은 45~50℃ 절편이 잘 보이도록 수조의 내부가 검은색으로 되어 있고, 온도조절장치가 있어서 원하는 온도를 지속적으로 유지 Cutting (박절)

27 Cutting (박절) 박절시 필요한 기구 신전기 (slide warming table)
Slide glass에 부착시킨 paraffin 절편을 녹이고, 부유온수조에서 묻은 수분을 건조하여 조직절편을 slide에 단단히 접착시켜주기 위해 사용 온도는 Paraffin의 융점보다 2~3 ℃ 높게 (60~62 ℃) 조절하여 사용 Cutting (박절)

28 Cutting (박절) 박절시 필요한 기구 Paraffin block 냉각용 얼음판과 얼음, 또는 freezing spray
50% alcohol 용액과 stain jar Paraffin block 가습기 (Humidifier) Slide marking pencil 과 붓, Section lifter Microtome, microtome knife, Slide glass Cutting (박절)

29 Paraffin block의 박절시 결함의 원인 – Rotary microtome의 경우
구부러지며 똑바로 나오지 않는 ribbon 칼날의 예리한 정도가 일정하지 않다. 한 쪽은 무디고 다른 쪽은 예리하다. 칼과 block이 평행하지 않다. Block이 정방형이 아니다.

30 Paraffin block의 박절시 결함의 원인 – Rotary microtome의 경우
짓눌리고 주름이 많은 ribbon 칼날이 무디다. 칼과 block의 온도가 높다. 칼의 틈의 각이 너무 크다.

31 Paraffin block의 박절시 결함의 원인 – Rotary microtome의 경우
조직이 뜯기거나 부스러지는 ribbon 탈수, 투명과정이 불완전하다. Paraffin의 crystal artifact가 유발되었다.(포매, 침투 시 65℃ 이상으로 paraffin을 오래 방치했을 경우) 조직 내부에 질긴 섬유성 조직이 들어 있다.

32 Paraffin block의 박절시 결함의 원인 – Rotary microtome의 경우
상처가 나며 수직으로 갈라지는 ribbon 칼에 흠이 나 있다. 칼 끝에 이물질이 묻어 있다. 조직 내부에 부분적인 석회화나 이물질이 들어 있다.

33 Paraffin block의 박절시 결함의 원인 – Rotary microtome의 경우
두꺼웠다 얇아졌다 하는 ribbon 칼과 block이 헐겁게 조여져 있다. 깍이는 조직 내부의 경도가 상이하다. Block이 너무 크다.

34 Rotary microtome을 사용하여 박절하고 있다. 다음 설명 중 틀린 것은?
오른쪽 핸들은 미동핸들이다 . 박절 전에 파라핀블록을 냉각하여 둔다 . 박절된 절편이 블록에 자주 붙을 때에는 가습기를 사용한다. 절편의 두께가 일정하지 않게 나오는 것은 칼날에 문제가 있다.

35 Sliding microtome이다. rotary microtome에 비해 다음 중 어떤 포매 조직의 박절에 효과적인가 ?
가. 큰 조직 나. 작은 조직 다. 딱딱한 조직 라 . 연속절편이 필요한 조직 1. 가, 나, 다 가, 다 3. 나, 라 가, 나, 다, 라

36 파라핀 절편을 부유온수조(flotation bath)에 띄우고 있다. 물의 온도가 40’C 이하라면 어떤 현상이 발생하겠는가?
1. 기포가 많이 발생한다 주름이 많이 발생한다. 3. 절편이 많이 갈라진다 리본이 낱장으로 분리된다.

37 박절시 파라핀 블록과 칼날과의 각도를 나타낸 것이다. 틈의 각(clearance angle)은 몇 도가 적당한가 ?
˚ ˚ ˚ ˚