Western blot.

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1 Western blot

2 실험 개요 Western blot Cell harvest Cell lysis 단백질 정량(Sampling)
Gel electrophoresis (SDS PAGE) Transfer Blocking Primary, secondary antibody incubation Developing (using chemidoc)

3 Introduction 단백질의 구조 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합 등
α-나선구조 β-병풍구조 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합 등

4 Introduction Cell Lysis

5 Introduction Cell Lysis 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 0.1% SDS
1% NP-40 0.5% DOC (deoxycholate) (Option!) Protease inhibitor cocktail

6 Introduction Western blot

7 Introduction Western blot DTT / β-Mercaptoethanol

8 Introduction BCA method
단백질 용액에 Cu2+ 이온을 반응시킨 후, Bicinchoninic acid(BCA)가 Trp, Tyr, Cys의 도움으로 Cu+ 이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 방법. - 562 nm 에서의 흡광도를 측정. - Standard curve로부터 농도를 결정. (Bovine serum albumin) - 다른 방법에 비하여 detergent (SDS, Triton) 등에 의한 영향이 적음. Bradford 용액

9 Introduction BCA method 1.083 0.689 Bradford 용액 OD값 BSA 250 500 1000
250 500 1000 2000 dosage 실험 결과 SDS-PAGE OD (y값) ug/ul (x값) X = (y )/0.0583 로딩량 (uL) /30ug 30/x값 5X loding dye DW (or RIPA) 총볼륨 =20uL A 1.083 1.7 4 14.3 20 B 0.689 2.8 13.2 Bradford 용액

10 Materials & Methods Cell Lysis
e-tube, scraper, PBS, centrifuge, RIPA, ice, DW, 96well plate, BSA, BCA [Dish에 직접 lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하는 방법] E-tube 2개를 준비하여 각각 A, B로 labelin한다. Dish에 있는 배지를 버린 후, DPBS 5ml을 넣고 washing 해준다. DPBS를 제거하고, 500μL의 RIPA buffer를 넣어주고, scraper를 이용하여 cell을 긁어서 떨어뜨리고, 이를 모아 각 e-tube에 넣는다. 15초간 vortex 하고, 30분간 ice에 incubation 해준다. (5-10분마다 15초씩 vortex 하여준다) 5. Cell을 모은 e-tube를 13000rpm으로 20분간 원심분리한다. 상층액을 따서 새로운 e-tube로 옮겨준다. (pellet까지 따지 않도록 조심하고, 이후 tube는 ice에 꽂아두도록 함)

11 Materials & Methods Sampling BSA BCA reagent (A : B = 1 : 50) 250 500
11. BSA (2000㎍/ml)을 DDW로 희석해 각각 (250, 500, 1000 ㎍/ml)을 만든다. 12. 96well plate에 BSA ( ㎍/ml)10㎕, sample10㎕, BCA reagent 200㎕를 순서대로 넣어준다. 13. 37℃ 에서 20분간 incubation 한다. 14. Microplate reader로 562nm으로 측정 후, 정량곡선을 그린다. 15. 정량을 마친 후, 5X sample buffer를 넣고 95도에서 15분간 끓인다. 16. Ice에서 5분간 식힌 후, spin down한 다음, -20도 냉장고에 보관한다 BSA 250 500 1000 2000 Sample A B BCA reagent (A : B = 1 : 50)

12 Result 1.083 0.689 Bradford 용액 dosage 실험 결과 SDS-PAGE OD (y값)
ug/ul (x값) X = (y )/0.0583 로딩량 (uL) /30ug 30/x값 5X loding dye DW (or RIPA) 총볼륨 =20uL A 1.083 1.7 4 14.3 20 B 0.689 2.8 13.2 Bradford 용액

13 Discussion Q. Lowry method, Bradford method에 대해 알아보세요

14 Report 12/7 5시 까지 제출