2018-2학기 생명과학 실험기법 RT-PCR & Western Blot 11주차 강의자료.

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1 2018-2학기 생명과학 실험기법 RT-PCR & Western Blot 11주차 강의자료

2 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR 또는 qPCR)의 정의와 목적
RNA의 정의 / 역할 / 구조 Ribonucleic Acid (RNA)는 오탄당의 일종인 Ribose를 기반으로 Nucleotide를 이루는 핵산 (Nucleic Acid)의 한 종류. 하나의 나선이 길게 꼬여 있는 구조를 지니며 DNA의 일부가 전사 (Transcription)되어 생성됨 RNA는 단백질을 합성하는 과정에 작용하며 일부 바이러스는 DNA 대신 RNA를 유전물질로 갖기도 함. 그러나, 대부분의 진핵생물 (Eukaryote)은 DNA가 유전자의 역할을 하고 RNA는 단백질 형성 과정을 담당함 DNA와 달리 핵염기로 Thymine 대신 Uracil을 갖음. RNA 스스로 효소와 같은 기능이 발견되었으며, Ribozyme이라 함

3 2) RNA의 종류 rRNA (Ribosomal RNA): 리보솜을 구성하는 RNA
mRNA (Messenger RNA): DNA의 유전정보를 옮겨적은 일종의 청사진 역할을 하며, 이를 기본으로 하여 리보솜에서 단백질을 합성 tRNA (Transfer RNA): mRNA의 Codon에 대응하는 Anticodon을 가지고 있으며, 꼬리쪽에는 해당하는 Anticodon에 맞추어 tRNA 와 특정한 아미노산을 연결해 주는 효소에 의해 Anticodon에 대응하는 아미노산을 달고 있음. tRNA 의 주요 역할은 리보솜에 들어온 mRNA에 따라 아미노산을 연결함 [RNA의 종류와 분포]

4 3) RNA의 정량 ① Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 의 원리와 목적
PCR법 (Polymerase Chain Reaction)은 내열성 DNA Polymerase와 두 개의 합성 Oligonucleotide (Primer)를 이용하여 목적 영역의 DNA를 특이적 증폭하는 방법. 따라서 극히 미량의 DNA를 고감도로 검출 가능. 특히, 역전사효소에 의한 cDNA의 합성반응과 RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)법을 병용함으로써 지금까지 검출이 어려웠던 미량의 RNA 바이러스 (HIV, HCV 등)를 검출하게 됨. qPCR의 경우 실시간 PCR 증폭 확인  샘플의 Starting cDNA 또는 RNA Concentration 측정이 목적 PCR의 결과는 Log Phase 합성기간 동안에는 비례하게 증폭 PCR을 통한 특정 절편의 증폭은 형광 증가량 측정으로 확인

5 ② PCR과 qRT-PCR의 차이 구분 RT-PCR (일반적) qRT-PCR (정량적) 분석
End-Point, Plateau Phase Log Phase Application 차이 정성분석 (Band Intensity 만으로 발현유무를 확인) 정량분석 (정확한 발현양을 수치로 확인 가능  민감도 높고 정확한 실험이 필요할 경우 주로 사용됨) 장단점 간편하고 쉽게 확인 가능 (정성분석) 별도의 형광시약 필요 (정량분석) 장비 일반 PCR 장비 qPCR 장비 데이터

6 PCR 반응시의 Plateau 효과 실제로 PCR을 해보면 증폭산물의 양이 처음에는 Cycle 수에 비례해서 대수적으로 증가하지만 증폭산물의 양이 어느 한도를 넘으면 증폭효율이 떨어지면서 최종적으로는 증폭하지 않게 됨. 이런 현상을 Plateau 효과라고 함.

7 4) Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 법
① 전체 과정 (Workflow) 1단계 (RNA 분리): 샘플로부터 mRNA 또는 Total RNA 분리. 일반적으로 Total RNA를 분리하여 사용 2단계 (cDNA 합성): RNA 샘플로부터 Primer를 사용하여 cDNA 합성과정 진행 3단계 (PCR): cDNA에 Specific Primer를 이용하여 PCR 과정을 통한 증폭, 결과 분석 [RT-PCR법의 순서]

8 [Nuclease-free water]
② RNA 추출 (RNA Preparation) * RNA 추출시 주의사항 RNA는 DNA처럼 안정한 상태가 아닌 Single Strand의 불안정한 상태이므로 Degradation이 쉽게 일어남 실험에 사용되는 모든 공간, 기기, Pipette 등을 70% 에탄올을 이용해 닦아주어 RNase를 최대한 제거 실험에 사용되는 Tube 나 Pipette Tip 등 모든 제품은 Nuclease-Free 제품을 사용 RNA나 관련시약을 취급할 때, 반드시 Latex Glove 착용 그 밖에 RNase-Free Reagents (Nuclease-Free Water 등) 나 RNase Inhibitor (RNaseZap) 을 사용 [Nuclease-free water] [RNaseZap]

9 * DEPC (Diethyl Pyrocarbonate)
단백질의 Histidine, Tyrosine residue 에 modification을 일으키는 물질 RNase를 inactivation 시키는 것으로 알려져 있으며, 용액 내에서 0.1% (v/v) 농도로 사용 RNA 분리 및 관련 실험에는 DEPC가 처리된 시약을 사용하도록 되어 있으며, 이것은 발암물질로 추정되므로 다루는 과정에서 항상 조심할 것 [DEPC-treated Water 제조방법] 증류수를 DEPC로 처리할 경우에는 DEPC를 0.1%로 증류수에 첨가한 후 하루밤동안 (O/N) stirring bar를 이용하여 섞어줌 (이때 Hood에서 작업하고, 37℃ 정도의 열을 가해주는 것도 가능) 다음날 아침 (DEPC 냄새가 나지 않으면) 자가멸균 (autoclave)하여 사용 (멸균을 통해 DEPC를 제거)

10 실험방법 – Easy-BLUE Total RNA Extraction Kit (인트론바이오)
배양된 세포의 기존의 배지를 제거하고, 1ml 의 Lysis Buffer를 넣어준다. (100-mm dish 기준) Scraper를 이용하여, 바닥에 붙은 세포를 긁어서 모아준다. Pipette을 이용하여 (세포를 긁어모은) Lysis Buffer를 1.5ml tube로 옮겨준다. Vigorously vortex in room temperature for 10 sec Add 200μl of Chloroform and apply vortex. After centrifuging the solution at 13,000 rpm (4℃) for 10 min, transfer 400μl of the upper fluid to an empty 1.5ml tube. Add 400μl of Binding Buffer and mix it well by pipetting or gently inverting the 2-3 times. Do not centrifuge and leave it for 1 min at room temperature. Column을 준비하고, 위의 800μl의 sample mix를 column에 넣어준다. Centrifuge at 13,000 rpm for 30 sec. Column 아래로 빠져나온 용액 (filtrate)을 버린다. Add 700μl of Washing Buffer A to the column. Add 700μl of Washing Buffer B to the column. Column membrane을 완전히 dry 하기 위해 아무것도 넣지 않고, centrifuge at 13,000 rpm for 1 min. 50μl의 Elution buffer를 column membrane의 중앙에 넣어주고, 1분간 대기한 후 centrifuge for 1 min at 13,000 rpm to elute. (이때 tip 끝이 membrane에 닿지 않도록 주의한다.)

11 ③ RNA의 농도 (Concentration) 및 순도 (Purity) 측정법
- Total RNA의 농도와 순도 계산을 위해 260nm (A260) 및 280nm (A280)의 흡광도를 측정함. dsDNA (double-strand DNA) = A260 × 50 = ng/㎕ ssDNA (single-strand DNA) = A260 × 33 = ng/㎕ RNA = A260 × 40 = ng/㎕ Q1. A260/280값이 낮다? A1. DNA의 농도가 낮은 경우 또는 단백질 오염도가 높거나 DNA가 녹아있는 용액의 pH가 낮은 경우 Q2. A260/230값이 낮다? A2. Contaminant가 원인. Carbohydrate, Phenol이나 Guanidine (일반적으로 Spin Column 방식의 RNA Lysis Buffer 성분으로 사용됨)이 남아있는 경우

12 5) 역전사효소 & cDNA 합성 정제된 RNA로부터 RT-PCR 또는 library를 제작할 경우, 우선 역전사효소 (Reverse Transcriptate: RTase)를 이용해 cDNA를 합성. 또한 역전사효소를 이용한 cDNA 합성에서는 RNA와 annealing 위치에 따라 3종류의 primer를 사용 Oligo dT primer : mRNA의 poly(A) tail에 annealing 되어, 3’ 에서부터 cDNA 를 합성 Random primer : mRNA의 모든 영역에서 cDNA 합성을 개시 (일반적으로 ~9nt 정도; nt: nucleotide) ex) Random hexamer Specific primer : 목적한 특정 cDNA만을 합성

13 1st strand cDNA 합성 아래의 반응액을 더하여 total 20 ㎕로 함. RNA template (1μg total RNA) Variable 5X Reaction Buffer ㎕ Reverse Transcriptase 1 ㎕ Nuclease-free water Variable (up to 20 ㎕) 2. 아래의 조건으로 반응 ① Priming 5 min at 25℃ ② Reverse Transcription (RT) 20 min at 46℃ ③ RT inactivation 1 min at 95℃ 3. 4℃ 또는 얼음에서 냉각 후 -20℃에서 보관

14 6) qRT-PCR 의 원리 형광표식 Probe에는 몇 가지 종류가 있는데, Interchelating법에는 일반적으로 SYBR Green I를 사용 Interchelating법 (SYBR Green I): SYBR Green I는 Double Strand DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약 (Interchelator)으로, Interchelator는 PCR 반응으로 합성된 Double Strand DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정함. 하지만 비특이적인 증폭에 의한 dsDNA에도 결합하기 때문에 특이도가 떨어지며, 많은 양을 사용하게 되면 PCR의 증폭효율을 떨어뜨리는 단점을 가지고 있음. - TaqMan probe법: 5’ 말단은 형광물질 (FAM 등)로 3’ 말단은 quencher 물질 (TAMRA 등)로 수식한 oligonucleotide (TaqMan probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법. TaqManTM probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridize하지만, probe상에 quencher에 의해 형광 발색이 억제됨. Extension 반응시에 Taq DNA polymerase가 갖는 5’ → 3’ exonuclease 활성으로 template에 hybridize한 TaqMan probe가 분해되어 형광색소가 probe에서 유리되면서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타냄.

15 Real-Time PCR은 절대정량 법 (Absolute Quantification)과 상대정량 법 (Relative Quantification) 두 가지 방법으로 결과를 분석하며, 상대정량 법은 서로 다른 실험군에서 조건에 따른 특정 유전자의 발현양상의 변화 또는 차이를 분석하는 방법으로 주로 RNA가 Target이며 결과 분석을 위해서는 대조군 (Reference)가 필요함. 주로 Drug Discovery나 유전자 발현양상 분석에 이용됨. Baseline: 일반적으로 3~15 Cycle 정도의 PCR 반응 초기 Cycle에서 나타나는 형광신호를 의미하며 Background 또는 Noise라고 함. Baseline 설정은 정확한 Ct 값을 결정하는데 영향을 줌. Threshold: Baseline보다 훨씬 증가된 신호로써 통계적으로 의미를 갖는 신호 수준을 나타냄. Background와는 다르게 증폭신호의 증가 양상이 뚜렷하게 구분되는 시점을 말함. Ct (Threshold Cycle): Threshold와 접점을 나타내는 형광신호의 Cycle 수를 의미함. Template의 양을 측정하는 데 이용되는 값을 말하며, 이론적으로 두 배 많은 양의 Template는 Ct 값이 1 Cycle 더 일찍 나타나게 됨.

16 7) qRT-PCR을 통한 데이타 분석 Ct 값을 이용해서 상대적인 발현양의 비율을 구하기 위해서는 기준이 되는 Internal Control (GAPDH, β-actin 등을 말하며, 예비실험을 통하여 Internal Control로 사용할 유전자에 대한 검토 필요)의 Ct 값도 산출해야 하며, Ct 값은 조건에 따라 달라질 수 있음으로 일반적으로 Internal Control도 분석하고자 하는 시료와 같이 Real-Time PCR을 수행하여 산출 시료의 유전자 발현량 차이는 분석시료의 Ct 값과 Internal Control의 Ct 값을 기준으로 △△Ct 값을 산출하여 2를 밑으로 하는 지수로 환산하여 산출 △△Ct 값을 산출하여 유전자의 발현을 비교하는 수식 Ct (Target Gene, Control) - Ct (Internal Control, Control) = △Ct (Control) Ct (Target Gene, Treatment) - Ct (Internal Control, Treatment) = △Ct (Treatment) △△Ct =△Ct (Treatment) - △Ct (Control) 유전자의 발현차 = 2^(-△△Ct) - 산출된 수치를 기준으로 시료간의 상대적인 유전자의 발현량을 비교, 확인

17 약물을 처리하지 않은 Control군과 약물을 처리한 Treatment군에서 CPT1 유전자의 발현량 측정 결과 (아래 결과는 각 샘플을 3번 반복하여 얻은 Ct 값이다.)
Gene Control (대조군) Treatment (실험군) CPT1 31 32.3 33.4 26 27.2 26.8 β-actin 17.2 18 19 17 17.5 Calculate △Ct value Average △Ct values between experiments (replicates) Calculate △△Ct values (△Ct treatment - △Ct control) Calculate fold change 2^(-△△Ct) CPT1 유전자는 Control군 (대조군)과 비교할때 Treatment군 (실험군)에서 32배 증가하여 발현하였다. CPT1 – β-actin 13.8 14.3 14.4 9 9.2 9.3 CPT1 – β-actin 14.17 9.17 CPT1 – β-actin -5.00 CPT1 – β-actin 32

18 Western Blot의 정의 및 목적 Western Blot : Protein Detection Southern Blot : DNA Detection Northern Blot : RNA Detection 단백질을 크기 별로 분리하는 기술로서 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 Detection 할 수 있음. Sample (Total Protein)을 SDS-PAGE를 이용해 분리하고, 이 단백질을 Membrane에 옮기는 과정을 거쳐 항원-항체 반응을 통해 발광을 유도함으로써 검출

19 1) 실험방법 및 원리 Western Blot Workflow (HRP 2차 항체를 사용하는 경우)

20 Protein Extraction: 세포 또는 조직에서 Protein을 추출해내는 과정
Protein Assay: 분리해 낸 Protein의 농도를 측정 SDS-PAGE: SDS Buffer로 (-)Charge를 띄게 한 후 (+)Charge를 연결해 Protein분자량 별로 분리해내는 과정 Transfer: Gel내부의 단백질은 항원이 결합할 수 없기 때문에 항원이 결합할 수 있는 Membrane으로 크기별로 분리된 단백질을 그대로 이동시키는 과정 Blocking: 단백질의 Transfer 되지 않은 부분이 다른 단백질로 오염되거나 Antibody가 붙을 수 없도록 Skim Milk 나 Bovine Serum Albumin (BSA) 등으로 Block 해주는 과정 항원-항체 반응: 원하는 단백질에 결합하는 1st Antibody (Ab) 와 1st Ab에 결합하고, HRP (Horseradish Peroxidase)가 부착된 2nd Ab와의 반응 Detection: 2nd Ab의 HRP가 ECL (Enhanced Chemiluminescence) 의 Luminol을 산화시켜 방출되는 빛을 검출함.

21 ① 단백질 추출방법 (Protein Extraction)
2) 실험과정 ① 단백질 추출방법 (Protein Extraction) - Protein 분리방법의 종류 (일반적인 방법으로, 경우에 따라 변경 가능)  Homogenization: 조직 또는 식물의 세포벽  Sonication: 조직  Freeze/Thaw: 식물  Reagent (Detergent): 동물세포 (가장 많이 이용되는 방법) - Reagent (Detergent)를 이용한Lysis Buffer의 종류 Detergent 작용효과 Anionic Detergent Membrane을 쉽게 분산시켜 버리지만 모든 Protein을 파괴하는 성질 (예: SDS, Cholic Acid-NA) Non-Ionic Detergent 일정 농도에서 Protein은 그냥 놔두고 Lipid Membrane만 파괴 (예: Triton X-100, NP-40, Tween-20) Amphionic Detergent 가용화 능력이 강하고 단백질 변성이 적음. pH 7 이하가 되면 용해도가 낮아짐. (예: CHAPS, CHAPSO)

22 Protease Inhibitor : Lysis Buffer 에 첨가하여 사용. Lysis가 시작되면 Proteolysis, Dephosphorylation, Denaturation 과정이 일어 나는데 나는데 이들 Inhibitor 를 처리함으로써 처리함으로써 늦출 수 있음. (4℃에서 Lysis를 진행하는 것도 이를 늦추기 위함) 또한 확인하고자 하는 단백질 중 인산화 형태(Phospho-)가 있다면 Phosphatase Inhibitor를 첨가함.

23 Bicinchoninic Acid Assay
② 단백질의 농도 측정 (Protein Assay) 단백질을 정량하는 과정. 각 Sample 내에 포함된 단백질의 양, 농도를 구하는 과정으로SDS-PAGE에 Loading 되는 Protein의 양이 동일해야 특정 단백질 양의 상대적인 값을 비교할 수 있음. Colorimetric Methods Lowry 방법 Bradford 방법 Bicinchoninic Acid Assay (BCA) 방법 특징 단백질 사슬의 아미노산에서 구리이온 (+2)의 아마이드 결합으로 환원 (+1) 되는 정도를 측정 Coomassie Brilland Blue G-250 Dye가 단백질과 결합시 465nm  595nm로 흡광도의 변화 측정 단백질이 구리이온 (+2)를 구리이온 (+1)로 환원시킬 수 있는 성질 이용. 562nm에서 측정 장점 감도가 좋으며 Bradford 보다 정확 5μg/μl의 낮은 농도까지 측정 가능 발색반응 2분 내 완료 빠르고 간단함 높은 감도 (1-20μg/μl) 다른 방법에 비하여 Detergent 등에 의한 영향이 적음 아미노산 조성에 따른 발색 정도의 차이가 적음. 단점 Detergent, Chemical 등의 물질에 의해 측정이 방해될 수 있음 준비과정과 시약이 복잡하고 시간이 많이 걸림. Detergent, 강염기 등에 의해 측정이 방해될 수 있음 단백질마다 Dye 와 결합정도가 다름 유리/플라스틱 큐벳 사용 반응시간이 느리고, 단백질의 변성이 있을 수 있음

24 ③ SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
SDS는 Native Proteins을 Individual Polypeptides로 Denature하는데 가장 자주 사용되는 시약 SDS를 넣고 100℃에서 단백질을 끓이면, SDS가 Polypeptide Backbone을 감싸게 되며. 이 과정에서 Polypeptide Chain 고유의 Charge는 잃어버리고 SDS에 의해 (-) 전하를 띄게 된다. (“Masking Effect”) *즉, SDS-PAGE는 질량의 차이를 이용한 분리 방법으로, SDS를 이용하여 모든 단백질이 동일한 (-)전하를 띄도록 만든 후, 질량에 의한 Polyacrylamide Gel 상에서 이동속도 차를 이용하여 분리하게 되고, 이 때 Sample Buffer에 Dithiothreitol (DTT)나 Mercaptoethanol이 첨가되어 Disulfide Bond도 끊어지게 되어 단백질은 1차구조를 형성하여 이동하게 되는 것 Stacking Gel: 로딩한 샘플 (단백질)들이 농축되어 Running Gel에 들어가기 전에 같은 출발선상에 위치하는 효과 Seperating Gel: 단백질이 크기와 Charge (+/-) 별로 전개/분리되는 부분

25 Sample Boiling (Denaturation): 정량이 끝난 후 SDS Buffer를 넣고 95℃에서 5분간 끓인다
Sample Boiling (Denaturation): 정량이 끝난 후 SDS Buffer를 넣고 95℃에서 5분간 끓인다. (Heat Block 이용) *Denaturation, 즉 3차 구조에서 1차 구조로 바꿔주기 위함.  SDS가 단백질을 둘러쌓아서 단백질 크기에 비례하는 전하를 띄게 해줘야 하는데, 단백질이 꼬여있으면 안쪽에는 SDS가 침투하지 못하므로 가열을 통해 단백질을 풀어줌으로써 SDS가 단백질의 크기에 비례하여 둘러쌓을 수 있게 해주는 것

26 Acrylamide: Separating Gel (Running Gel) 경우 Acrylamide Gel의 농도를 이용하여 단백질의 이동속도를 조절. Acrylamide의 농도가 높아지면 Gel 내부의 그물구조가 더욱 촘촘해지므로 단백질들의 이동속도 차이를 더욱 높일 수 있음. APS (Ammonium Persulfate): 자유반응기를 생성하여 Acrylamide와 Bis-acrylamide의 Polymer를 형성. 4℃ (장기보관시 -20℃)에서 보관하며, 시간이 지남에 따라 서서히 분해되므로 1~3주가 지나면 새로 만들어 사용하는 것이 좋음. TEMED (N, N, N', N'-Tetramethylethlenediamine): APS로부터 생기는 Free Radical의 생성을 촉매하여 Acrylamide와 Bisacrylamide의 Polymer 형성을 촉진. TEMED는 자유염일때만 작용하므로 낮은 pH에서는 Polymer 형성이 방해받음.

27 ④ Transfer SDS-PAGE를 통해 분리한 단백질을 Membrane으로 옮기는 과정 단백질이 SDS로 인해 (-) 전하를 띄는 성질을 이용한 것으로 Gel 쪽을 (-), Membrane 쪽을 (+)로 하여 단백질을 전기장을 걸어주어 Membrane 쪽으로 이동 Membrane으로 옮겨진 단백질은 항체를 이용하여 검출이 용이 Gel 내부에 있는 단백질은 항체와 결합할 수 없기 때문에 Membrane 위로 단백질들을 옮겨서 항체가 결합할 수 있도록 하기 위해 Blotting을 하는 것

28 - Membrane의 종류 종류 장점 단점 Nitrocellulose (NC) 한번에 많은 Antibody 흡착이 가능
PVDF 보다 저렴한 가격 (경제적) Non-Specific Binding에 대한 차단이 빠르고 간단함. 재질이 Hydrophilic 하여 단백질이 Membrane에 붙는 힘이 상대적으로 약함. Reprobing* 과정에 의해 단백질이 떨어질 수 있음. 재질이 약해서 오래 보관하기 어려움. Polyvinylidene Fluoride (PVDF) Specific 결합으로 선명한 밴드모양을 형성 재질적 견고함과 결합력으로 강한 Washing에 견딜 수 있음. Membrane이 쉽게 상하지 않음 (쉽게 찢어지지 않음) 단백질 결합능력이 큼 NC에 비해 가격이 비쌈 NC에 비해 Stripping*이 잘 안됨. Methanol로 미리 적셔두어야 함 (Hydrophobic한 표면을 지닌 PVDF의 원단 특징이 Transfer가 가능한 Hydrophilic 하게 변화시키기 위한 과정) *Reprobing: Membrane에 결합된 항체 (1st, 2nd Ab)를 떨어뜨린 후 (Stripping), 새로운 항체를 반응시키는 과정

29 ⑤ Blocking 단백질이 붙지 않은 Membrane의 여백에 5% Skim Milk (또는 3% BSA)의 단백질이 붙어서 Antibody의 Non-Specific Binding을 피하기 위함. Blocking Buffer (5% Skim Milk in TBS-T)를 Membrane이 잠기도록 넣고 1시간 동안 상온에서 Shaking. ⑥ 항원-항체반응 항체 (Antibody): 항원 (Antigen)과 결합하는 단백질을 말하며, 혈액과 체액에 녹아있는 Immunoglobulin (Ig)을 지칭  Fab (Antibody Binding Fragment): 항원과 결합할 수 있는 조각  Fc (Crystalizable Fragment): 항원과 결합하지 못하는 조각

30 단일클론항체 (Monoclonal Antibody) 다클론항체 (Polyclonal Antibody)
단일클론항체 (Monoclonal Antibody) 다클론항체 (Polyclonal Antibody) 특징 하나의 Epitope에 반응하고 분자구조가 동일한 하나의 B 림프구 (B Cell)에서 만들어진 한 종류의 항체 여러 Epitope에 반응하고 (Target은 하나), 여러 종류의 B 림프구에서 분비된, 항원 결정기가 일정하지 않은 여러 종류의 항체 사용 발현성이 높은 단백질 정확한 Target Binding이 필요할때 (주로 단백질 구조 분석, 세포 신호전달에서 사용됨) 발현성이 낮은 단백질 (주로 Immunoprecipitation (IP) 실험시에 항체와 항원의 결합을 최대화 하기 위해 사용됨)

31 Horseradish Peroxidase (HRP) 또는 Alkaline Phosphatase (AP) 이용
⑦ Detection Horseradish Peroxidase (HRP) 또는 Alkaline Phosphatase (AP) 이용 Horseradish Peroxidase (HRP)의 원리 Luminol이 Peroxidase (HRP) 에 의해 산화되면서 푸른색 빛을 내는 것을 X-ray Film상에 감광시키는 방법으로 단백질을 검출 현상한 필름에서는 검출된 Protein에 해당하는 띠 모양이 어두운 영역으로 보임. 다른 레인에서의 서로 다른 띠 모양의 밀도는 비교되어 검출하려 한 Protein의 양에 대한 정보를 제공 이와 같이 Luminol을 이용한 Develop을 ECL (enhanced chemiluminescence)이라 하며, ECL용액은 구입하거나 직접 제조하여 사용 가능

32 방법 ECL Solution을 Membrane Size에 맞춰 필요한 만큼 1:1로 Mix 함. (제품에 따라 다를 수 있음)
Washing이 끝난 Membrane을 OHP Film 위에 놓고, 만들어놓은 ECL Solution을 Pipette 으로 조심스럽게 Membrane에 묻혀주고, 1~2분간 Incubation 함. 반응이 끝난 Solution을 OHP Film을 기울여 휴지에 흡수시켜 제거함. Membrane 위에 다시 OHP Film을 겹치고 Membrane과 OHP Film 사이에 Bubble 생기지 않도록 휴지로 살살 밀어줌. Chemi-doc (imaging system) 또는 필름을 이용해 노출 정도를 조절하여 Western Band를 검출함. [LAS-3000, FUJIFILM] [Western Blot Cassette]