핵산의 Quality Control DNA & RNA 정량 Agarose gel 을 이용한 DNA&RNA전기 영동

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1 핵산의 Quality Control DNA & RNA 정량 Agarose gel 을 이용한 DNA&RNA전기 영동
PCR분석 – 핵산의 Quality Control 핵산의 Quality Control DNA & RNA 정량 Agarose gel 을 이용한 DNA&RNA전기 영동

2 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
DNA & RNA정량 핵산을 이용하여 다양한 실험을 수행하기 위해서 시료부터 핵산을 추출하는데, 추출된 핵산의 양(yield)과 순도(Purity)는 이 후 수행될 여러가지 실험의 성패를 좌우하는 매우 중요한 요소이기 때문에, 핵산 추출후에는 반드시 핵산의 양과 순도를 측정하여야 한다. 핵산의 양을 측정하기 위하여 주로 2가지 종류의 분광계가 사용된다. Spectrophotometer 2) Nano drop형 Spectrophotometer

3 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
DNA, RNA의 정량 어떤 분자가 잘 흡수하는 특정한 파장의 빛을 투과시켜 흡광도를 측정함으로서 그 분자의 정량적인 분석이 가능하다. DNA와 RNA와 같은 nucleic acid는 260nm 파장에서 최고의 흡광도를 보인다. 유사파장에서 간섭이 가능한 물질로는 protein이 있는데 이들은 UV 범위 내 280nm에서 최고 흡광도를 보이며, 유기용매의 경우 230nm에서 흡광도를 보인다. A260/A280 비율 => Protein의 오염 여부와 nucleic acid의 purit를 예측할 수 있다. dsDNA 의 경우 1.7이상, ssDNA, RNA는 1.8이상인 경우, quality 좋다고 판단한다. A260/A230 비율 => 유기용매의 오염 여부와 nucleic acid의 purity를 예측할 수 있다. A260/A230 ratio가 인 경우, quality 좋다고 판단한다.

4 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
-시료가 Double-strand DNA일때 260nm 흡광도 값이 1이라면 50ug/ml이다. -시료가 RNA일때 260nm 흡광도 값이 1이라면 40ug/ml이다. -시료가 Single-strand DNA일때 260nm 흡광도 값이 1이라면 33ug/ml이다

5 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
-예를 들어 dsDNA 시료량이 50ul DNA 시료 10ul 를 990ul 증류수와 혼합하여(1/100희석) 260nm로 흡광도를 측정하였더니 흡광도가 0.4였다면 DNA농도 = 0.4 x 50(ug/ml) x 100 = 2000ug/ml 50ul에는 100ug의 DNA가 있는 것이다. 예제 1) RNA 70ul가 있다. 이것을 1/10희석하여 흡광도를 측정하였더니 A260 = 1.25였다. 이시료의 농도(ug/ml)와 총량은? 예제 2) DNA 140ul가 있다. 이것을 1/100희석하여 흡광도를 측정하였더니 A260 = 0.25였다. 이시료의 농도(ug/ml)와 총량은? 예제 3) DNA 100ul가 있다. 이것을 1/100희석하여 흡광도를 측정하였더니 A230 = A260= A280=0. 28 이시료의 농도(ug/ml) 와 순도는 얼마인가?

6 실험방법 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
DNA 10ul와 증류수 990ul를 희석 하여 Cuvette에 넣는다. Spectrophotometer를 이용하여 230nm, 260nm, 280nm에서의 흡광도를 측정한다. 각각의 측정값을 기록한 후 계산한다. RNA 10ul와 증류수 990ul를 희석 하여 Cuvette에 넣는다.

7 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
전기영동 전기영동(electrophoresis)은 생체 고분자들의 성질을 연구하고, 그것들을 분석, 분리, 정제하는 중요한 방법 중에 하나이다. 전기영동법으로 DNA, RNA나 단백질 등을 분리할 수 있는 것은 이들 분자가 고유의 전하(-)를 띠고 있어 전기장(electric field)에 놓이게 되면 서로 다른 속도로 이동할 수 있다는 것에 근거하고 있다. 전기영동의 원리 완충용액 속에서 DNA RNA, 단백질등은 음전하를 띠며, 용질 혼합물에 전기장을 걸면 음전하를 띤 물질(DNA, RNA, 단백질)은 양극으로 이동한다. 음전하를 띤 물질의 움직이는 속도는 전하의 크기 및 전기장의 세기에 비례 하고, 분자의 크기와 gel의 점도에 반비례한다. 현재 널리 쓰이는 전기영동법은 젤(gel) 전기영동법으로 아가로오스 젤, 폴리아크릴아미드 젤 및 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel eletrophoresis) 젤을 사용한다.

8 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
아가로오스 겔 전기영동 아기로오스 젤(agarose gel)은 해상도는 낮으나, 아주 넓은 범위(200 bp~50 kb)의 DNA나 RNA 시료를 간편하게 분리할 수 있기 때문에 가장 흔히 사용된다. 아가로오스는 해초에서 추출되는 선형중합체 형태의 물질이다. 아가로오스를 적당한 완충용액(TAE or TBE)에 녹여서 원하는 크기의 틀에 부어서 겔이 굳은 후에 사용한다. 전기장하에서 음전하를 띠는 DNA가 양극으로 이동하는 데 일반적으로 DNA의 크기와 전기장에서의 이동성(mobility)은 반비례한다. 왜냐하면 큰 분자는 작은 분자보다 젤의 구멍을 지나가기 어렵기 때문이다. 같은 크기의 DNA 분자라도 아가로오스의 농도가 커지면 아가로스 겔의 그물구조(network structure)가 촘촘해지기 때문에 이동속도가 작아진다. 따라서 아가로오스의 농도에 따라 DNA의 분리범위가 다르다. 아가로오스의 농도가 0.3 %(w/v)로 낮을 때는 5~60 kb의 비교적 큰 DNA를 분리하며, 아가로오스 농도가 2.0 % (w/v)로 높을 때는 0.1~2 kb의 작은 DNA 를 분리한다.

9 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
완충용액 전기장에서 DNA의 이동성은 완충용액의 이온 강도와 조성에 영향을 받는다. 이온 강도가 너무 낮으면 DNA 이동이 너무 느리고, 이온 강도가 너무 높으면 열이 발생하여 심한 경우 겔이 녹거나 DNA의 구조가 변형된다. 실험실에서 많이 사용하는 완충용액으로는 Tris-Acetate EDTA(TAE)와 Tris-Borate EDTA(TBE)가 있다. 50X TAE Stock Solution 242 g Tris Base (MW=121.1) 57.1 mL Glacial Acetic Acid 100 mL 0.5 M EDTA bring final volume to 1 L with ddH2O. store at room temperature.

10 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
(5000bp) (1900bp)

11 Agarose gel 을 이용한 전기 영동 PCR분석 – 핵산의 Quality Control 실험 재료 1) 전기영동장치
3) 0.5X TAE Buffer 4) EtBr(Ethidium Bromide) or Gel-Red 5) 삼각 flask 6) 6X loading dye 7) RNA or DNA

12 2.실험방법 PCR분석 – 핵산의 Quality Control - Buffer 제조
50X TAE Buffer를 이용하여 0.5X TAE Buffer 500ml 제조 (50X TAE Buffer 5ml + DW 495ml) - Agarose gel 제작 1) 1% Agarose (in 0.5X TAE) 을 만든다. - Agarose : 0.5g + 0.5X TAE : 50ml 2) 전자레인지에서 1분 30초 간 가열한다 ) 실온에서 약12분간 식힌다 ) 적당히 식은 Agarose용액에 gel red 5ul를 넣는다 ) 4)의 Agarose용액을 틀에 넣고, Comb을 꽂고 굳힌다.(약 30분간) 6) 전기 영동장치를 0.5XTAE buffer로 채운다 ) 5)에서 굳은 Agarose gel에서 Comb을 빼고 6)의 buffer가 채워진 전기 영동 장치에 넣는다. 8) Agarose gel이 잠길때 까지 buffer를 채운다.

13 2.실험방법 PCR분석 – 핵산의 Quality Control
- DNA 및 RNA sample 준비 및 전기영동(Electrophresis) 1) 빈 2개의 EP tube에 각자의 이름을 적고 그 위에 DNA, RNA를 적는다. 2) EP tube에 6X DNA loading dye를 2ul씩 넣는다. 3) 2)에 EP tube에 DW 9ul(DNA) 9ul(RNA)씩 첨가한다. 4) 3)에 DNA 1ul와 RNA 1ul를 첨가한다. 5) Tapping 하여 micro centrifug에서 spin down한다. 4) gel에 만들어진 well(홈)에 각각의 sampl을 loading 한다. 5) 전기영동을 시작한다. (100V 에서 20분간) 6) UV lamp를 이용하여 RNA band를 확인한다.

14 PCR분석 – Agarose 전기영동 EtBr(Ethidium Bromide) Gel green(or Gel red)