P C R 분 석 신 유 근 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)

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1 P C R 분 석 신 유 근 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
P C R 분 석 신 유 근

2 PCR 개요 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
1983년 Kary Mullis에 의해 고안. DNA 중합효소를 이용하여 DNA, RNA의 특정영역을 시험관 내에 대량으로 증폭 80년대 제한효소(restriction enzyme)의 발견에 의한 gene cloning법 이후, 90년대 생명공학 연구의 혁명적인 사건 연구하고 싶은 유전자는 무엇이든 대량 생산이 가능.

3 2. PCR 목적 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
복잡한 전체 genome 중에 연구하고자 하는 유전자만을 확인하고자 할때 PCR은 특정 DNA sequence의 copy 수를 기하급수적으로 증폭시킴 증폭된 DNA를 여러 가지 실험에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 분자생물학, 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학 연구에 응용할 수 있음

4 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)

5 3. PCR 구성 요소 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
Template : DNA, cDNA PCR Primers : 증폭할 부분을 잡는 짧은 염기서열. Taq polymerase : 열에 특별히 강한 유전자 합성효소 (Taq polymerase: Thermus aquaticus 라는 온천에 사는 세균의DNA polymerase, 72℃가 최적온도, 94℃에서도 안정함) 4) dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 각 뉴클레오티드 염기들 5) MgCl+2 : MgCl2+은 dNTP와 복합체를 형성하여 효소활성, primer annealing 등에 관여

6 4. PCR 원리 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
DNA polymerase의 성질을 이용하여 단일가닥 DNA, RNA를 주형으로 상보적인 DNA 합성 (5’ → 3’ 합성) 1. ds DNA의 denaturation step 2. Primer의 annealing step 3. Polymerase에 의한 DNA synthesis step (extension) 위의 세단계를 반복하여 수행함으로써, in vitro에서 DNA를 증폭

7 5. PCR 의 3 단계 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
DNA의 변성(denaturation) Primer의 결합(Annealing) DNA의 합성(polymerization, extension) DNA 의 변성(denaturation) : -90℃∼96℃로 가열하여 두가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리. -일반적으로 94℃사용: 높은 온도일수록 단일가닥 DNA로 잘 이행되지만 온도가 너무 높으면 Taq DNA polymerase 역시 activity(활성)가 낮아짐. -첫 Cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킴. -이 후의 cycle에서는 약 30초~1분간 변성시킴.

8 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
Primer 의 결합(annealing) : ℃∼65℃에서 진행. -30sec~1min. -염기 간의 결합은 G, C의경우 세군데 에서 수소결합이 일어나고 A, T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합 온도 결정. -Primer design시에 Annealing temperature를 고려해야 함. -일반적으로 GC content가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직.

9 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
DNA의 합성(polymerization, extension) : ℃∼74℃에서 시행. -1min ~ 1min 30sec. -Taq DNA polymerase의 합성 속도: 2,000∼4,000 nucleotides/min, 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당. -원하는 PCR 산물의 크기가 크 거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장할 수 있음 -Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며 마지막 cycle 에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주어서 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 함.

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ccttcattgagaccaagtacgctgtgagtattcaccccactttacccctccatcatgatg ggaataactctgg aggtgtactac

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Primer 제작

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Primer 제작

14 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
100bp marker 1500bp 1000bp 500bp

15 Primer 제작 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction) ※좋은 primer의 조건
두 primer의 Tm값이 비슷해야 한다. g-c: a-t =1:1에 가까운 값을 가져야 한다. primer-dimer가 되지 않도록 주의한다. aaaa 등의 같은 sequence가 오지 않도록 한다

16 6. PCR 실험 시 유의하여야 할 사항 PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction)
Template 의 순도 및 농도. MgCl2의 농도. Annealing temperature: 50℃∼65℃, G+C 비율에 따라 온도 결정. 4. Primer sequences : 일반적으로 GC contents가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 좋다. 5. DNA Polymerase의 종류.

17 1. PCR PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction) 1)실험 재료
(1) Template(DNA or cDNA) (2) Primer(Reverse and Forward) (3) DNA ladder maker (4) PCR reagent - 10X buffer - 25mM MgCl2 - 2.5mM dNTP - Taq-Polymerase (5) PCR machine (6) 전기영동장치 (7) Agarose (8) 0.5X TAE buffer (9) EtBr

18 5. PCR PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction) 1)실험방법
(1) PCR kit에 Primer-F와 Primer-R을 각각 1ul씩 넣는다. (2) (1)의 tube에 각자의 DNA template을 2ul씩 넣는다. (3) (2)의 tube에 DW를 16ul씩 넣는다. (4) (3)의 tube를 tapping하여 잘 섞는다. (5) spin down을 한다. (6) PCR machine에 넣고, 아래와 같은 program으로 PCR machine을 작동시킨다. ① 94℃ 5분 ② 94℃ 30초 ③ 57℃ 30초 ④ 72℃ 30초 ⑤ Go to ② repeat 25cycle ⑥ 72℃ 10분 ⑦ 4℃ Hold

19 5. PCR PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction) 1)실험방법
(4) PCR machine에 넣고, 아래와 같은 program으로 PCR machine을 작동시킨다. ① 94℃ 5분 ② 94℃ 30초 ③ 57℃ 30초 ④ 72℃ 30초 ⑤ Go to ② repeat 25cycle ⑥ 72℃ 10분 ⑦ 4℃ Hold (5) PCR하는 동안 1%Agarose gel을 만든다. ① Agarose 0.4g + 0.5X TAE 40ml 전자레인지 30초 씩 3번 ② 적당히 식으면 EtBr 4ul를 넣고, gel 틀에 넣고 comb을 꽂는다 (6) Gel이 완전히 굳으면 0.5X TAE buffer가 담겨져 있는 전기영동 장치에 Gel을 넣는다.

20 5. PCR PCR분석 – PCR (Polymerase Chain Reaction) 1)실험방법
(7) PCR이 끝나면 100bp marker와 PCR Product를 well에 넣고 전기 영동을 시작한다. - 100bp marker ; 8ul - PCR product ; 20ul 100V에서 20분간 running한다. (8) 전기영동이 끝나면 gel image machine으로 PCR결과를 확인한다.

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