탄수화물 염색 (carbohydrate staining)

Presentation on theme: "탄수화물 염색 (carbohydrate staining)"— Presentation transcript:

1 탄수화물 염색 (carbohydrate staining)

2 탄수화물 (Carbohydrate) 실험식 (CH2O)n
Polyhydroxyaldehydes 나 polyhydroxyketones 또는 가수 분해 시 이러한 화합물을 생성하는 물질 인체의 에너지원 지질과 결합; 당지질(glycolipid) 단백질과 결합; 당단백질(glycoprotein)

3 탄수화물의 분류 단당류 (monosaccharide) 이당류 (disaccharide)
올리고당류 (oligosaccharide) 다당류 (polysaccharide)

4 조직 내 탄수화물의 분류 표 조직 내 탄수화물의 분류(Culling, 1974)

5 상피층에 나타나는 점액 원 자 단 명 칭 분 포 Neutral (1:2 glycol) gastric mucin 위점막, 전립선
carboxylated (1:2 glycol, COOH) sialomucin 소장점막, 침샘 sulfated(1:2 glycol, COOH, OSO3H) sulfated 대장점막

6 (acid- mucopolysaccharide)
결합조직 점액 (acid- mucopolysaccharide) 원 자 단 명 칭 분 포 Carboxylated (COOH) hyaluronic acid 태반, 피부결합조직 Sulfated (COOH & OSO3H) chondroitin sulfate A & B 연골, 심장판막 chondroitin sulfate B, heparin 대동맥, 비만세포 sulfated (OSO3H) keratosulfate 연골, 추간판

7 탄수화물의 고정 당원(glycogen)의 고정 점액질의 고정
탄수화물은 대부분 수용성이어서 비수용성 고정액으로 고정해야 이상적이나, 조직 내에서 탄수화물은 단백질과 공유결합을 하고 있어 alcohol 고정액 이외 수용성 고정액으로도 고정 가능 당원(glycogen)의 고정 alcoholic-formalin 고정액으로 4℃에서 고정 작은 glycogen 과립도 잘 증명 absolute alcohol 이나 carnoy sol., formal-alcohol sol. 등도 이용 점액질의 고정 alcoholic – formalin, 10% neutral buffered formalin 등 일반적인 formalin 계 고정액이 적합 탄수화물의 고정

8 1:2 glycol의 산화 - aldehyde 형성
산성기를 가진 복합 탄수화물을 염기성염료(basic dyes)로 염색하는 방법 탄수화물의 염색 염 색 원 리 염 색 방 법 1:2 glycol의 산화 - aldehyde 형성 PAS 염색법 염기성 염료로 산성기의 증명 alcian blue 염색법 colloidal 염색법 이염색성 염료로 산성기의 증명 이염색성 염색법 전통적인 방법 Best carmine 염색법 Mucicarmine 염색법 효소 이용법 diastase-PAS 염색법

9 Periodic acid schiff reaction (PAS) For Neutral polysaccharide

10 염색원리와 목적 당원, 점액, 각종미생물, 기저막 등을 선명하게 볼 수 있어서 당원과 관련된 피부 및 간질환, 감염성 질환, 사구체질환, 암 종류의 구별, 암의 원발장기 규명 등에 결정적 정보를 제공 조직표본의 탄수화물 분자구조에서 인접한 glycol groups (CHOH-CHOH)을 periodic acid로 산화시키면 탄소결합(C-C)이 분리되면서 조직절편 내의 1.2 glycol기를 갖는 탄수화물을 산화하여 탄수화물의 ester나 glycosidic linkage가 변화되어 aldehyde group을 유리

11 aldehyde기는 Schiff's reagent (Leukofuchsin)와 결합하면 quinoid계 발색단(붉은색)을 형성하여 적색 정색반응
periodic acid (과요오드산)의 농도는 0.5%~1%가 적합 염색반응 후 sulfurous 용액으로 rinse 하는 것은 Schiff solution에 의한 과도의 false pigment를 방지하기 위함이다.

12 Schiff 시약 용액 제조법 증류수 200ml에 염기성푹신(basic fuchsin) 1gm 을 용해하고 끓는점까지 가온
50℃까지 온도를 내린 후 1N-HCl 20ml를 첨가 완전히 식힌 후 메티아황산나트륨 1gm을 첨가 갈색병에 넣어 냉장고에 보관 이 용액은 광선이 통하지 않는 암소에 48시간 이상 방치해 두면 표백되어 짚색(straw color)으로 변화 - Charcol 1~2 gm을 가하여 잘 흔든 후 여과하여 사용

13 Schiff 시약 사용 여부 검사법 증발접시에 37∼40% formaldehyde(100% formalin)
10ml 정도 붓고, 제조한 schiff reagent를 몇 방울 떨어뜨렸을 때, 즉시 연분홍색(red-purple)으로 변하면 사용에 좋은 시약 변질된 schiff reagent는 발색시간이 길다. 짙은 청색(deep purple) 색으로 변하면 사용불가

14 참고 당질을 산화하는 고정제가 들어 있는 고정액은 사용할 수 없다. Periodic acid를 산화제로 선택하는 이유는 과산화를 시키지 않는다는 점이다. Aldehyde 기가 과산화되면 carboxylic acid가 되는데 이것은 결과가 약하게 나타난다. Chromic acid나 potassium permanganate, osmic acid 등을 함유한 산화제는 형성된 aldehyde기를 과산화시킨다.

15 PAS 염색 양성반응 물질 Glycogen neutral mucosubstance basement membrane
reticulum fiber and collagen fiber amyloid fungus

16 Periodic acid schiff reaction(PAS)

17 Periodic acid schiff reaction(PAS)
신장의 사구체

18 Periodic acid schiff reaction(PAS)
Fungus Lung candidiasis

19 Diastase PAS 염색 당원이 diastase에 소화됨을 근거로 하여 PAS 양성물질의 소실 여부를 판단
Picric acid가 포함된 고정액과 celloidine 표본은 diastase-소화를 방해 Diastase PAS 염색 PAS d-PAS Mucin + Glycogen (-)

20 고정 및 기법 Fixative 10% alcoholic formalin, absolute alcohol, carnoy 용액 등
Paraffin cut section μm Control - alcohol용액에 고정된 liver, 정상피부조직

21 방법 Deparaffinize and hydration washing
Diastase 소화용액과 buffer solution 을 혼합한 후 37℃에서 1 hour incubation하여 glycogen을 제거 Tap water 10 min washing 1 % periodic acid solution 10min oxidation Schiff reagent 25 min washing Harris hematoxylin 2min stain Tap water washing 1% HCl alcohol 3~5 회 dip Dehydration clearing mounting

22 글리코겐증(glycogenosis) 환자의 간조직
<PAS> <diastase-PAS> 글리코겐증(glycogenosis) 환자의 간조직

23 염색은 pH 9~11 사이에서 음이온으로 하전된 carminic acid의 수소원자와 glycogen에 있는 OH기 사이의 수소결합에 의한 것
Best Carmine 염색

24 Carmine 저장액 조제법 증류수 60ml에 carmine 염료를 용해하면서 Potassium carbonate와 potassium chloride를 첨가하여 약 5분간 서서히 끓여준다. 용액이 식으면 ammonia solution conc. 를 첨가하고 갈색병에 여과하여 냉장고에 보관한다. 제조 후 2~3 개월간 사용이 가능하다. (Potassium carbonate와 potassium chloride salt는 조직 내의 염기성 단백질과 음전하로 하전되는 carmine의 정전기적 결합을 억제시키는 역할을 한다. 이들은 오직 당원과 carmine 사이의 수소결합만 일어나도록 해준다.)

25 방법 Deparaffinize and hydration washing
Mayer hematoxylin 용액에 15min nucleus stain Tap water 15 min washing Best의 carmine solution, 15~30 min stain 수세하지 않고 감별용액에 10 sec 가량 differentiated Dehydration : rinse in fresh alcohol clearing mounting 감별용액 absolute alcohol ml Methyl alcohol ml D.W ml

26 간세포 내 글리코겐이 적색으로 염색

27 점액물질(Mucosubstance) 염색
Mucins 점액물질이란 순수한 탄수화물이 아니고 단백질이나 지질이 복합체를 구성하고 있는 물질의 총칭 일반적으로 상피성 점액과 결합조직 점액으로 구분 상피성점액 염색법의 종류 McManus의 PAS 염색법 (McManus's, 1906) Mayer's Mucicarmine 염색법 Southgate's mucicarmine 염색법 (modified from Mayer) 점액물질(Mucosubstance) 염색

28 Mucicarmine 염색 상피세포로부터 분비되는 점액의 증명
Carmine 염료와 aluminum(매염제)의 결합물(dye-mordant)가 mucin과 반응하면, 적색에서 진한 장미색으로 발색 선상피와 편평상피에서 유래되는 종양 구별 cryptococcus의 협막이 염색되어 진균감염을 진단 정확한 염색 기전이 밝혀져 있지 않다. Mucicarmine 염색

29 Mucicarmine 저장액 Carmine (Oil No. 75470) ------ 3.0 gm
Aluminium chloride gm D.W ml 삼각플라스크에 위의 시약을 넣고 가열하여 dark purple 색의 syrup 용액으로 만든다. 50% alcohol 100ml를 붓고 overnight 후 filter

30 방법 Deparaffinize and hydration washing
Weigert hematoxylin 10 min stain Tap water 10 min washing Mucicarmine 용액 30~40 min stain D.W 회 washing 0.25% metanil yellow solution 1min stain D.W 회 dip washing Dehydration clearing mounting

31 Mucin ------------- red deep rose
Cryptococcus capsule -- red-deep rose Nuclei bluish black Background yellow 작은창자 점막. 창자융모상피 사이에 존재하는 술잔세포(goblet cells)가 양성반응을 보이며, 융모의 표면을 따라 나타나는 줄무늬가장자리(striated border)도 약한 양성반응을 보인다. A. 저배율 B. 고배율

32 산성 점액물질 (acid mucosubstance) 염색
정상적으로 인체에 존재 - 혈관벽에는 정상적으로 hyaluronic acid, chondroitin sulfate A와 C, dermatan sulfate, heparin sulfate 같은 acid mucosubstance가 존재 이 물질은 유전적 대사이상으로 그 양이 증가 - collagen disease의 경우, 양이 증가 - 죽상경화증 (atherosclerosis)의 조직 부위에 증가

33 염색법 alcian blue 염색 colloidal iron 염색 이염색성 염색

34 Alcian blue (pH 2.5) 염색 Alcian blue:
다가(polyvalent) 음이온의 염기성 염료로 수용성 분자 내 구리(copper, Cu++) 이온이 존재하여 푸른색을 띤 (+)로 하전되기 때문에, 낮은 pH에서 산성점액물질의 산성기 (-)와 정전기적 으로 결합하여 염색 (낮은 pH상에서 alcian blue 염료는 산성점액의 산성기와 염결합(salt linkage)에 의해) Carboxyl기나 sulfate기를 갖는 산성 mucin과 sialomucin이 같이 염색 (중성점액은 제외) Alcian blue (pH 2.5) 염색

35 보통 alcian blue pH2.5 염색액을 사용
carboxylated와 sulfated acid mucosubstance를 증명 alcian blue pH 1.0 염색액을 사용하여 sulfated acid mucosubstance를 증명 alcian blue-PAS 이중 염색으로 acid mucosubstance는 blue, neutral mucosubstance는 reddish purple로 감별

36 고정 및 기법 Fixative -10% Neutral buffered formalin, - Bouin’s
Paraffin section - 4-6 μm Control (대조조직) - Small Intestine, salivary gland, appendix, or colon

37 방법 Alcian blue solution (pH 2.5) Deparaffinize and hydration washing
3 % glacial acetic acid solution에 5 min간 감작 1 % Alcian blue solution 30 min stain Tap water 5 min washing Nuclear fast red solution 5 min 대조염색 Tap water 3~5회 dip (가급적 짧고 신속히 진행) Dehydration clearing mounting Alcian blue solution (pH 2.5) - Alcian blue, 8GX (C.I 74240) gm 3% glacial acetic acid m 용해한 후 여과하고 진균 방지를 위해 thymol 결정을 조금 첨가 용액은 2개월 간 안정

38 <HE> <Alcian blue>

39 청색으로 염색된 세포와 분비 물질이 맞게 연결된 것은? 3. 비만세포- 산성점액 4. 파네트세포-라이소자임
소장점막의 alcian blue 염색이다. 청색으로 염색된 세포와 분비 물질이 맞게 연결된 것은? 1. 목점액세포-중성점액 술잔세포-산성점액 3. 비만세포- 산성점액 파네트세포-라이소자임

40 Alcian blue (pH 1.0) stain for Sulfated acid mucosubstance
방법 Deparaffinize and hydration washing Alcian blue pH 1.0 solution에 30 min stain 0.1 N HCl solution으로 신속히 헹군다. 여과지에 물기를 흡착한 후 건조시킨다. 물에 수세하지 않는 것은 pH의 변화로 인한 비특이성 염색반응을 일어나지 않도록 Nuclear fast red solution 5 min counterstain 증류수로 신속히 헹군다. (가급적 짧고 신속히 진행) Dehydration, clearing ,mounting

41 sulfated acid mucosubstance -- blue nucleus -------------- pinkish red
cytoplasm pale pink Alcian blue (pH 1.0)

42 Alcian blue-PAS 염색 점액을 분비하는 선암과 미분화성 상피암을 감별 산성 점액물질은 alcian blue에 염색
중성 점액물질과 그 외의 PAS 양성물질은 Schiff 시약에 염색 (단, 상피세포에 함유된 점액과 연골 같은 물질은 alcian blue와 PAS 염색이 복합되어 나타남) Alcian blue-PAS 염색

43 Deparaffinize and hydration washing
3% acetic acid solution에 3min 간 처리 Alcian blue solution (pH 2.5)에 30min간 stain Tap water 10 min washing 후 증류수로 여러 번 헹군다. 0.3% sodium carbonate solution에 10 min 간 처리한다. (이 때 alcian blue는 약알카리 처리로 불용성이 된다.) 1 % periodic acid solution에 5 min간 산화시킨다. 증류수에 2~3회 수세한다. Schiff reagent에 10min stain Sulfurous rinse solution 에 2min 씩 3회 처리한다. Tap water 10 min washing Harris hematoxylin 용액에 3 min 간 핵염색을 한다. Tap water 1 min washing

44 Acid mucosubstance --------------- blue
Epithelial mucin purple Cartilage purple Neutral mucosubstance, PAS 양성물질 reddish purple nuclei dark blue cytoplasm, background pale pink

45 용액 내에서 생성된 염기성염료가 점액물질의 산성기와 이온결합 High Iron Diamine(HID) – Alcian blue for sulfated and carboxylated mucins HID solution N,N-dimethyl-meta-phenylenediamine-dihydrochloride N,N-dimethyl-para-phenylenediamine-dihydrochloride Distilled water Freshly prepared 60% ferric chloride == Dissolve the two diamine salts in the distilled water and then add the ferric chloride solution. Alcian blue solution (pH 2.5)

46 방법 Deparaffinize tissue in distilled water. Treat in HID solution at room temperature for 18~24 hours. Rinse in running tap water. Stain in Alcian blue solution（pH2.5）for 5 minutes. Briefly wash with water. (If necessary, counterstain nuclei to fix the red color.) Dehydrate, clear and mount with mounting media by following routine procedure.

47 Sulfated mucins ----- Purple to Dark brown
Carboxylated Mucins Blue Nuclei Red (Counterstain nuclei to fix the red color) 시알로뮤신분비 술잔세포는 밝은 청색 설포뮤신분비 술잔세포는 흑청색