생명과학 실험 미생물 배양 (Ⅰ) 생화학 연구실 김현우.

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1 생명과학 실험 미생물 배양 (Ⅰ) 생화학 연구실 김현우

2 원핵 생물과 진핵 생물 생물을 원핵 생물과 진핵생물로 나눌 수도 있다.
앞에서 Bacteria와 Archeae 는 원핵생물이며 eukaryota는 진핵생물이다. 비교적 간단한 원핵 생물은 cell wall(세포벽)이 있고, eucaryote에 있는 Golgi, endoplasmic reticulum, mitochondria 같은 세포 소기관들이 없다. 원핵생물과 진핵생물의 가장 큰 차이점은 핵막이 존재하는지 안하는지이다. 원핵생물은 핵막이 없는 대신에 chromosome 들이 모여서 nucleoid(핵양체)를 이루고 있다. 그렇기 때문에 원핵생물에서는 전사와 번역이 동시에 일어날 수 있다. 진핵생물에서는 DNA가 핵에서 전사되면 cytosol에서 번역이 일어난다.

3 미생물 (Microorganism) 미생물이란? 육안의 가시한계를 넘어선 0.1mm 이하의 크기인 미세한 생물
주로 단일세포 또는 균사 조류(algae), 세균류(bacteria), 원생동물류(protozoa), 사상균류(fungi), 효모류(yeast), 바이러스(virus) 등

4 E.coli (Escherichia coli)
Chromosome Plasmid : pET24b – CcJCN (kanr) 오늘 우리가 사용할 미생물은 E.coli, 대장균이다. 사람을 포함해서 포유류의 장관을 기생장소로 하고 있는 장내세균으로, 통성혐기성 그람음성의 간균이며 글루코오스를 분해하여 산을 생산한다. 사람이나 동물의 분변에 오염된 외계에널리 존재하기 때문에 음료수, 수영장이나 식품의 변질에 의한 오염을 검사하는 지표가 된다. 지금까지 건강인의 장관에 상재하고 있기 때문에 장관 내에 존재하는 한 병원성은 없는 것으로 여겨지며 특히 대장균K12주(E. coli K-12)는 분자생물학과 생물공학의 연구재료로서 널리 이용되어 왔다. 오늘 우리가 사용할 대장균은 ER2566이라는 이름을 가진 대장균이다. 연구 목적으로 유전자 재조합에 의해 내가 원하는 단백질의 유전자를 삽입 했을 때 lac operon의 조절을 받아 overexpression 시킬 수 있도록 만든 대장균이다. 내가 키운 ER2566 cell에는 pET24라는 벡터(플라스미드)에 CcJCN이라는 단백질이 들어가 있고 kanamycin에 저항성을 가지고 있다. Host strain for the expression of a target gene cloned in the pTYB vectors. Carry a chromosomal copy of the T7 RNA polymerase gene inserted into lacZ gene and thus under the control of the lac promoter. In the absence of IPTG induction expression of T7 RNA polymerase is suppressed by the binding of lac I repressor to the lac promoter. Deficient in both lon and ompT proteases.

5 Lac operon

6 미생물 생장 조건 영양 산소와 특정 균종에 필요한 기체 성분 습기 pH 온도 오염이 없어야 한다.

7 미디어(media)의 성분 탄소 질소 무기성의 인과 황 미량 원소들 물 비타민 탄소원
세포의 증식, 유지, 산물의 생성과 관련되어 있는 모든 생합성 과정에 필요 에너지원으로 사용 당밀, 맥아 추출물, 녹말, 덱스트린, 아황산 폐액, 섬유소, 유청, 알칸 & 알코올, 지방 & 오일 질소원 단백질 합성을 위한 필수 성분 무기 또는 유기 질소원 모두를 이용할 수 있음 무기 질소원 : 황산암모늄, 인산수소암모늄 유기 질소원 : 옥수수침출액, 효모추출물, 펩톤, 대두박

8 LB (Lysogeny Broth) Media
Luria broth, Lennox broth, or Luria-Bertani medium Bacteria의 culture에 이용(주로 E.coli) 성분 Yeast extract Tryptone NaCl Lysogeny : 용원성 Broth : 수프 Peptides and peptones are provided by tryptone. Vitamins and certain trace elements are provided by yeast extract. Sodium ions for transport and osmotic balance are provided by sodium chloride. Bacto-tryptone is used to provide essential amino acids to the growing bacteria, while the bacto-yeast extract is used to provide a plethora of organic compounds helpful for bacterial growth. Tryptone protein을 산이나 알칼리 효소에 의해서 불특정 무작위로 분해하여 가용성 물질로 만든것 을 peptone 이라 합니다. 분해시 trypsin을 이용하여 생성 시킨 peptone을 tryptone 이라 합니다. 질소원으로 이용됩니다.

9 미생물 생장 곡선 (Bacterial Growth Curve)
생장유도기(Lag phase) 접종균이 새로운 환경에 적응하는 시기 성장에 필요한 효소나 세포 구성성분의 합성이 완비된 상태 X → 재합성이 이루어 질 때까지 걸리는 시기 대사가 왕성한 균: 유도기 짧다, 노후된 균: 유도기 김 대수증식기(expotential phase) 세포의 수가 2의 지수적으로 증가하는 시기 미생물 세포의 증식이 활발 미생물의 생장률: 배지의 성분, 구비된 조건, 미생물의 종류에 따라 달라짐 정지기(Stationary phase) 영양분의 고갈, 대사산물의 축적 시기 신생되는 세포의 수 = 사멸되는 세포의 수 생존 미생물의 수가 변동 없는 시기 사멸기(Death phase) 사멸 세포수의 증가 → 생존 미생물의 수 감소 시기 미생물의 종류에 따라 사멸기의 기간 다름 생균수 급격히 감소, 현탁도는 서서히 감소 (사멸균의 용해(lysis) 까지 상당 시간 소요)

10 흡광도(Optical Density) Aλ = log10(I0/I1) Absorbance Aλ : Absorbance
I1 : Intensity of the radiation (transmitted radiation) I0 : Intensity of the radiation ( incident radiation In spectroscopy, the absorbance (also called optical density[2][3]) of a material is a logarithmic ratio of the radiation falling upon a material, to the radiation transmitted through a material.[4] Absorbance measurements are often carried out in analytical chemistry. In physics, the term spectral absorbance is used interchangeably with spectral absorptance or absorptivity. In this case it has a slightly different meaning: the fraction of radiation absorbed at a specific wavelengths. Absorbance is a quantitative measure expressed as a logarithmic ratio between the radiation falling upon a material and the radiation transmitted through a material. ,where is the absorbance, is the intensity of the radiation (light) that has passed through the material (transmitted radiation), and is the intensity of the radiation before it passes through the material (incident radiation). Outside the field of analytical chemistry, e.g. when used with the Tunable Diode Laser Absorption Spectroscopy (TDLAS) technique, the absorbance is often defined using the natural logarithm instead of the common logarithm, i.e. as where is the intensity of light at a specified wavelengthλ that has passed through a sample (transmitted light intensity) and is the intensity of the light before it enters the sample or incident light intensity (or power). The term absorption refers to the physical process of absorbing light, while absorbance refers to the mathematical quantity. Also, absorbance does not always measure absorption: if a given sample is, for example, a dispersion, part of the incident light will in fact be scattered by the dispersed particles, and not really absorbed. However, in such cases, it is recommended that the term "attenuance" (formerly called "extinction") be used, which accounts for losses due to scattering and luminescence.[5] See the Beer-Lambert law for a more complete discussion. Although absorbance does not have true units, it is quite often reported in "Absorbance Units" or AU. 흡광도는 용액의 농도와 액층의 길이(l)에 비례한다. 어떤 물질 에 특정 파장의 빛을 통과시키면 물질이 빛을 흡수하기 때문에 물질을 통과한 빛은 intensity(빛의 세기)가 감소한다. Sample에 cell이 많을 수록 빛의 intensity가 감소하기 때문에, 흡수되는 빛의 세기를 이용해 cell의 농도를 알 수 있다. OD값은 죽은 cell에 대한 sensitivity가 거의 없다.

11 실험 방법 Seed culture : LB 100ml에 cell 1ml 넣고 overnight culture (37℃) → 4 ℃에 보관 200ml 플라스크에 LB 100ml 넣고 seed culture 1ml을 접종 37℃에서 incubation 24시간 동안 매 3시간마다 OD600 값 측정 Bacterial growth curve 그리기

12 실험 방법 Seed culture : LB 15ml에 cell 1ml 넣고 overnight culture (37℃)
15ml tube에 LB 5ml 넣고 seed culture 1ml을 접종 1시간, 2시간, 3시간, 5시간, 7시간 전에 각각 cell을 접종 37 ℃ 에서 incubation OD600 값 측정 큐벳(cuvette)에 각 sample 1ml 씩 넣어서 측정 Bacterial growth curve 그리기 OD600

13 실험 방법 다음주 실험 준비 (Sampling) OD값 측정 후 cell 200μl을 1.5ml tube에 넣는다
13000rpm 1분 30초 centrifuge 상층액을 빼낸다 20mM Tris을 30μl 넣고 re-suspension 2X SDS sample buffer를 30μl 넣는다 100℃에서 15분 동안 heat 13000rpm 15분 centrifuge 상층액을 다른 tube에 옮겨서 -20℃에서 보관

14 예비 실험 결과

15 예비 보고서 SDS-PAGE의 원리 다음 주 실험 결과 예상