효소를 이용한 간 기능 검사.

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1 효소를 이용한 간 기능 검사

2 실험 목적 GOT • GPT를 이용한 간 기능 검사
생체에서 단백질 합성, 포도당 및 탄수화물 대사, 핵산 대사, 지질 대사, 약물 대사 등을 담당하는 중요한 기간인 간은 여러 질환들로 인해 손상 될 수 있다. 간 손상을 정확히 진단하기 위해 효소를 이용한 생화학적 방법들을 통하여 간 기능 검사를 진행하여 본다. 주요 검사로는 AST(GOT), ALT(GPT) 등이 있다.

3 Introduction GOT • GPT Aminotransferase(transaminase)의 활성 측정
: aminotransferase는 keto acid와 amino acid 간 amino 기의 교환을 촉매하는 효소 ① AST(aspartate aminotransferase) = GOT (glutamic oxaloacetic transaminase) ② ALT(alanine aminotransferase) = GPT (glutamic pyruvate transaminase) 간세포 내에 존재하는 효소들로 주로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출되어 혈중 수치가 증가하게 된다. 급성 간세포 손상 초기에는 간 세포 내 농도가 높은 AST가 ALT보다 더 많이 증가하지만 24~48시간 뒤에는 반감기가 긴 ALT가 더 높아진다. 알코올성 간염에서는 AST가 더 증가하고, 만성 간세포 손상에서는 ALT가 더 높다.

4 Introduction AST(=GOT) ALT(=GPT) GOT • GPT
Aspartate + α-ketoglutarate → glutamate + oxaloacetate oxaloacetate + dinitrophenylhydrazine → hydrazone 생성된 colored hydrazone을 spectrophotometer로 측정 ALT(=GPT) Alanine + α-ketoglutarate → glutamic acid + pyruvate pyruvate + dinitrophenylhydrazine → hydrazone 생성된 colored hydrazone을 spectrophotometer로 측정

5 Materials & Methods GOT • GPT GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약, 마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer ▶ 표준곡선 작성 1. 시험관 번호 1~5의 순서대로 검량용 시약을 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4ml씩 분주한다. 2. GOT 기질액 또는 GPT 기질액을 순서대로 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6ml씩 분주한다. 3. 각각의 시험관에 증류수 0.2ml, 정색시약 1ml씩 분주한다 N NaOH를 10ml씩 분주하여 잘 혼합한 후 실온에서 10분간 방치한다. 5. 증류수를 대조로 하여 spectrophotometer의 파장 505nm에서 흡광도를 측정한다. 6. Transaminase 활성치의 단위를 X축, 흡광도를 Y축으로 하고 각각의 흡광도 실측치와 그에 해당하는 transaminase 단위와의 대응점을 연결하여 GOT 및 GPT용 표준곡선을 작성한다.

6 Materials & Methods GOT • GPT GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약, 마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer ▶ 시료 측정 작성 1. GOT/GPT 기질액 각 1ml을 37℃ waterbath에서 5분간 가온한다. 2. 마우스 혈청 10ul를 각 기질액에 섞어 37℃ waterbath에서 GOT는 60분, GPT는 30분간 가온한다. 3. 정색시약 1ml과 잘 혼합한 후 실온에서 20분간 방치한다 N NaOH 10ml과 혼합한 후 실온에서 10분간 방치한다. 5. 증류수를 대조로 하여 spectrophotometer의 파장 505nm에서 흡광도를 측정한다.

7 Materials & Methods GOT • GPT GOT용 기질액, GPT용 기질액, NaOH, 정색시약, 검량선용 시약, 마우스 혈청, water bath, spectrophotometer, vortex mixer ▶ 측정상의 주의 사항 N NaOH 10ml을 넣을 때는 5초 이내에 분주할 수 있는 구멍이 큰 것을 사용 한다.  Serological pipet & pipet aid 이용 2. 혈청을 넣을 때는 정확도가 높은 마이크로 파이펫을 사용한다. 3. 효소 반응의 온도 및 시간을 정확히 취한다. 4. 표준 곡선에서 벗어나는 높은 치를 나타내는 혈청에 대해서는 생리식염수로 정확히 희석하여 얻은 측정치에 희석배수를 곱하여 준다.

8 기질액 (GOT/GPT) 1ml 혈청 10ul 정색시약 1ml 0.4N NaOH 10ml
60분 이내에 505nm(490~530nm) 파장에서 증류수를 대조로 흡광도 측정 37℃ 5분 37℃ GOT : 60분 GPT : 30분 실온 20분 혼합 실온 10분

9 Results 측정한 시료의 흡광도를 표준곡선에 대입하여 구해보고, 나온 값이 정상치인지 확인한다. GOT • GPT 정상치
GOT : 8~40 karmen 단위 GPT : 5~30 karmen 단위