Western blot 생명과학 실험기법 (13주차).

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1 Western blot 생명과학 실험기법 (13주차)

2 11/23일 실험 개요 Western blot Cell harvest Cell lysis 단백질 정량 (Sampling)

3 실험 개요 Gel electrophoresis (SDS PAGE) Transfer Blocking
Primary, secondary antibody incubation Developing (using film)

4 Sampling Introduction

5 Introduction SDS-PAGE

6 Introduction SDS-PAGE

7 Introduction Western blot

8 Introduction Transfer

9 Introduction Blocking
단백질의 Transfer 되지 않은 부분이 다른 단백질로 오염되거나 antibody가 붙을 수 없도록 Skim milk 나 BSA 등으로 Block 해주는 과정

10 Materials & Methods Sample preparation
샘플 단백질 정량 결과 SDS-PAGE OD (y값) 농도 (x값, μg/μl) X = (y )/0.0376 A: 단백질 (30 μg) B: 5X dye C: DW 총부피 (A+B+C) C 0.245 3.2 μg/μl 9.4 μl 4 μl 5.6 μl 20 μl T 0.204 2.1 μg/μl 14.2 μl 1.8 μl e-tube에 계산한 양만큼의 A, B, C 를 넣어준다. Vortex, spindown Heat block에서 95℃, 10min

11 Materials & Methods Western blot
Cassette 밑의 스티커를 제거하고 Gel tank에 넣은 후 고정시킨다 Running buffer를 채운다 Marker 7ul 와 준비한 sample을 20ul를 gel에 로딩한다 80V로 30분 running 120V로 1시간 30분 정도 running

12 Materials & Methods Transfer
Transfer 준비 : tray에 transfer buffer, 작은 통에 메탄올, 3M paper 2개, PVDF 1장 (조 이름 기입), 핀셋 Cassette에서 gel을 꺼내 stacking gel과 밑 끝 부분을 제거한다 (Gel이 찢어지지 않도록 조심) -> tray로 옮긴다 PVDF(연필로 조 이름 기입)를 메탄올에 30초 담근 후 tray로 옮긴다 Transfer cassette - sponge - 3M paper - membrane – Gel - 3M paper sponge 순서로 쌓는다 Transfer tank에 buffer, 얼음팩, cassette를 넣고 100V로 1시간 transfer

13 CPT1 : 88kDa β-actin : 42kDa

14 Blocking Materials & Methods 5% skim milk in TBS-T 용액에 1시간 incubation