생물분리정제공학 생명체 기본구성분자의 이해.

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1 생물분리정제공학 생명체 기본구성분자의 이해

2 세포의 화학적 조성 생물분리정제공학 탄수화물 지질 단백질 핵산
- 탄소, 수소, 산소로 구성되며 포도당은 세포 에너 지 원의 주된 공급원, 다당류는 세포의 구성 요 소 및 저장물질. 지질 - 친수성 머리부분과 소수성 꼬리부분으로 구성 되며 세포막의 기본 구성 요소이고, 신호 전달기 능을 수행하고 인지질은 세포막의 주된 구성성 분이며 콜레스테롤과 스테로이드 호르몬 등도 지질의 한 종류. 단백질 - 20가지 아미노산이 펩티드 결합을 한 중합체, 3 차 구조는 기능 결정에 중요한 역할. 핵산 - 유전정보를 가지는 DNA와 RNA로 되어 있고 염 기, 당, 인산으로 구성된 뉴클레오타이드 중합체.

3 세포내 유전물질의 구성 생물분리정제공학 유전물질 (DNA and RNA)의 이용 1. 복제(Replication)
2. 정보의 저장(Storage of information) 3. 정보의 발현(Expression of information) 4. 돌연변이에 의한 변화(Variation by mutation)

4 deoxythymidine (thymidine)
생물분리정제공학 DNA 와 RNA의 분자구조 Nucleotide - 당(sugar) - 인산기(phosphate group) - 질소염기(nitrogenous bases) DNA ; Deoxyribonucleic acid RNA ; Ribonucleic acid Abbr. Base Nucleoside Nucleic Acid A Adenine deoxyadenosine DNA adenosine RNA G Guanine deoxyguanosine guanosine C Cytosine deoxycytidine cytidine T Thymine deoxythymidine (thymidine) U Uracil uridine

5 DNA의 이중나선 구조 생물분리정제공학 Complementary structure ;
[ phosphoester bond ] Complementary structure ; The two strands of DNA are arranged antiparallel to one another: viewed from left to right the "top" strand is aligned 5' to 3', while the "bottom" strand is aligned 3' to 5'. This is always the case for duplex nucleic acids. G-C base pairs have 3 hydrogen bonds, whereas A-T base pairs have 2 hydrogen bonds: one consequence of this disparity is that it takes more energy (e.g. a higher temperature) to disrupt GC-rich DNA than AT-rich DNA. Base paring of nucleic acids ;

6 아미노산의 특성 및 구조 아미노산 (amino acid) 아미노산 (amino acid) 구조 생물분리정제공학 ① ② ③ ④
- 생물의 몸을 구성하는 단백질의 기본 구성단위이다. 단백질을 완전히 가수분해하면 암모니아와 아미노산이 생성되는데, 아미노산은 아미노기와 카르복시기를 포함한 모 든 분자를 지칭한다. - 생화학에선 흔히 α-아미노산을 간단히 아미노산이라 부른다. α-아미노산은 아미노 기와 카복시기가 하나의 탄소(α-탄소라 부른다.)에 붙어있다. 프롤린(proline)은 실제 로는 아미노기를 포함하지 않기 때문에, 엄밀하게 말해서 아미노산이 아니라, '이미 노산'(imino acid)이다. 그러나, 생화학적으로 다른 진짜 아미노산과 비슷한 기능을 수행하기 때문에, 아미노산으로 분류한다. 아미노산 (amino acid) 구조 ① a hydrogen ② a carboxyl group ③ an amino group ④ a unique side chain or R(residue)-group - 곁사슬의 성질에 따라 산성, 염기성, 친수성(극성), 소수성(비극성) ① ③ ② ④

7 아미노산의 종류 필수아미노산 비필수아미노산 생물분리정제공학
- 단백질의 기본 구성단위로 사람이나 동물이 질소평형을 유지하고 정상적인 성장이나 건강을 유지할 수 있을 정도로 체내에서 합성할 수 없는 아미노산. 필수아미노산의 종 류는, 성인의 경우에 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 트레오닌, 리신, 페닐알라닌, 트 립토판 등 8종. 어린아이의 경우에는 여기에 히스티딘이 추가. -고등동물은 일부 아미노산의 탄소골격을 적절한 속도로 합성할 수 없음 비필수아미노산 - 다른 아미노산이나 당질, 지질대사 중간체로부터 합성되는 아미노산 - 아미노기전이효소(transaminase)에 의해서 체내에서 필수아미노산으로부터 합성할 수 있으나, 글루타민 ·아스파라긴 ·알라닌 ·프롤린 등의 비필수 아미노산은 훨씬 용이 하게 아미노기전이반응이 일어나서 다른 비필수아미노산을 합성 가능.

8 생물분리정제공학

9 탈수반응에 의한 아미노산의 결합 생물분리정제공학
Proteins are polymers of amino acids joined together by peptide bonds. There are 20 different amino acids that make up essentially all proteins on earth. Each of these amino acids has a fundamental design composed of a central carbon bonded to: - a hydrogen - a carboxyl group - an amino group - a unique side chain or R-group Peptide bonds are formed between the carboxyl group of one amino acid and the amino group of the next amino acid.

10 아미노산의 물리적 성질 생물분리정제공학 용해도 자외선 흡수스펙트럼
- 아미노산 중에서 tryptophan, cysteine 이외에는 물에 용해하며 proline, hydroxyproline은 알코올에도 용해한다. 대부분의 아미노산은 물, 포화 butanol에 녹지만 ether, chloroform, benzene등의 유기용매에는 녹지 않음.   자외선 흡수스펙트럼 - 아미노산 중에서 방향족아미노산인 phenylalanine, tryptophan, 및 tyrosine 은 자외선을 흡수. - 단백질이 280nm 부근의 자외선을 흡수하는 것은 바로 이들 아미노산들 특히 tryptophan이 함유되어 있기 때문. [방향족아미노산의 자외선 흡수스펙트럼]

11 아미노산의 산,염기 특성 생물분리정제공학 양성전해질(ampholyte) 등전점(isoelectric point, pI)
- 수용액 중에서 산성과 염기성 양쪽의 성질을 나타내는 물질을 말하며 모든 아미노산은 양성전해질. - α-아미노산은 수용액에서 치환기 R-이 이온형으로 존재하는 것도 있지만 일반적으로 아미노산의 α-탄소에 결합하고 있는 아미노기와 카르복시기의 성질에 따라 양성전해질이라 할 수 있음. 등전점(isoelectric point, pI) - pH의 변화에 따라 변하는 아미노산의 구조의 total electronic charge가 0 이 되는 pH - 등전점에서는 아미노산의 이동이 없음 - 등전점에서는 단백질이 불안하게 되어 수용액 상태에서 침전을 형성함. 용해도, 삼투압이 낮아짐 침전 시 단백질의 점섬이 낮아짐 흡착성과 기포성이 커짐 (쌍성이온) OH- H+ pI=(pKa1+pKa2)/2

12 아미노산의 분리 닌히드린 반응 종이 크로마토그래피 생물분리정제공학
- α- 아미노산(그리고 펩타이드, 단백질등)은 pHl4~8, 100℃근처에서 닌히드린과 반응하여 자주색 또 는 붉은 자주색의 착색물질을 만든다. - 착색물질의 색깔은 아미노산에 따라 다르며, 아미노산인 proline과 hydroxy-proline의 경우는 황색이 다. - 닌히드린 시험은 매우 sensitive하기 때문에 아미노산 및 단백질의 확인에 보편적으로 쓰일 뿐 아니 라 아미노산의 정량에도 이용. 종이 크로마토그래피 - 크로마토그래피는 혼합물로부터 그 성분들을 순수하게 분리하거나 확인, 정량하는데 사용하는 편 리한 방법 중의 하나 - 이 방법에 의한 물질의 분리는 혼합물이 정지상이나 이동상에 대한 친화성이 서로 다른 점을 이용하 는 것으로, 이 친화성에 중요한 영향을 미치는 인자는 흡착, 이온화 및 분배계수들로써 여러 종류의 크로마토 그래피는 이들 인자가 서로 합하여 작용. - 종이 크로마토그래피는 원리상으로 분배 크로마토그래피의 일종. - 거름종이 대신에 유리판에 실리카겔, 셀룰로오스 분말 또는 산화 알루미늄 등과 같은 지지체의 얇은 막을 입힌 것을 사용

13 생물분리정제공학 단백질의 분자 구조 및 특성 단백질은 아미노산(amino acid)이라고 하는 비교적 단순한 분자들이 연결되어 만들어 진 복잡한 분자, 대체로 분자량이 매우 큰 편, 단백질을 이루고 있는 아미노산에는 약 20 종류, 아미노산들이 화학결합을 통해 서로 연결되어 폴리펩티드(polypeptide)를 만듦. 아미노산의 사슬 사이의 여러 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 반데르발스 힘, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합에 의하여 입체구조를 형성. 온도가 높아지면 단백질의 구조를 유지하는 여러 결합들이 깨어지며, 급격한 pH의 변 화는 단백질을 구성하고 있는 분자의 이온 구조의 급격한 변화를 초래하여 단백질이 원 래 가지고 있던 특성을 잃어버려 원래의 상태로 돌아가지 못하는 비가역적 현상이 발생. 분자량은 초원심분리기를 사용하여 침강계수에 따라 결정하거나 겔 여과법(gel filtration), SDS-겔 전기영동법으로 측정. 1차 구조 ; 아미노산의 배열순서 2차 구조 ; 알파(α)나선 구조(나선형으로 꼬임), 베타(β) 구조(병풍구조), 불규칙 꼬임. 3차 구조 ; 입체구조, 단백질 접힘(protein folding)에 의해 대부분 구형을 이루고 특유의 구조로서 특이적인 반응을 이끌어 냄. 4차 구조 ; 3차 구조의 단밸질 분자가 2개 이상 모여 하나의 집합체를 구성하여 특정 생 물학적 기능을 나타냄.

14 생물분리정제공학 Protein 의 일반적 성질 Protein 의 분리 열에 대한 응고성 산이나 염기에 대한 변성
중성염((NH4)2SO4)에 의한 침전 유기용매에 의한 침전 중금속에 의한 침전 – Hg, Ag, Cd, Cu, Pb등이 단백질과 결합하여 응고 Protein 의 분리 세포외 단백질 – 원심분리후 상층액 세포내 단백질 – 원심분리후 침전물(세포) → 파쇄 물리적방법; sonication, pressure ★ 일반적 정제방법 화학적 방법; 효소이용 - lysozyme, cellulase, 중성염에 의한 침전 Dialysis (투석) 이온교환 컬럼 크로마토그래피 Gel filteration 순도 검정 – 전기영동, 초원심분리

15 유전정보의 흐름 ( DNA↔RNA → Protein )
생물분리정제공학 유전정보의 흐름 ( DNA↔RNA → Protein ) ① mRNA is transcribed from a DNA template by DNA dependent RNA polymerase ② mRNA move from nucleus into cytoplasm via nuclear pore ③ polypeptide translated from mRNA template by ribosome and tRNA

16 단백질 실험의 진행방법 생물분리정제공학 [단백질의 기능해석의 기본적인 흐름] 생물활성 생물활성 해석
항체제작(면역조직화학, 항원정량법의 확립, 항원정제) 정제단백질 게놈정보 발현해석 상호해석 정보 해석 생리기능해석 cDNA 생물활성 해석 항체제작(면역조직화학, 항원정량법의 확립, 항원정제) 입체구조 해석 (NMR,X선 해석, 전자현미경) 정제재조합단백질

17 단백질의 생리기능 해석법 생물분리정제공학 Target gene /protein cDNA or Genomic DNA 정보검색
Homology 기능 domain, 입체구조의 예측 발현정보 세포level에서의 해석 cDNAs (정상, 변이체, dominant-negative체)의 도입 siRNA, antisense RNA 도입 정제 단백질과 중화항체의 영향 결합분자의 검색 분자의 국재와 통태의 가시화 (1분자 관측) Target gene /protein cDNA or Genomic DNA 개체level에서의 해석 항체와 DNA probe를 이용한 발현분석 유전자/cDNA의 직접 도입 cDNA도입세포의 이식 유전자 결손(파괴) 마우스(개체)의 제작 유전자 도입 마우스(개체)의 제작 정제 단백질 생물활성의 측정 작용기구의 해석 상호작용해석 입체구조해석 1분자관측

18 단백질 실험 시 유의점 단백질 실험실 포인트 단백질을 안정하게 보관하기 위한 주의 생물분리정제공학 좋은 검정계를 보유
좋은 재료를 선택 단백질 변성, 실활을 최소한으로 함 목적단백질의 물성, 특지율 숙지 단백질을 안정하게 보관하기 위한 주의 저온(1~5 ℃ )에서 처리와 보존한다. 가능한 한 단시간에 처리한다. 가장 안정한 pH에 보관한다. 안정화 시약을 첨가한다. Pretease 저해제를 첨가한다. 격렬한 교반 등을 피한다. 장기보존의 경우는 동결보존한다. (가능하면 초저온 냉동고사용)